La determinación de endotoxinas bacterianas: ¿cómo evitar la contaminación de las muestras durante la manipulación?

La manipulación de las muestras a las que se les va a realizar el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) es clave en los resultados obtenidos. Las endotoxinas bacterianas son el contaminante pirógeno más frecuentemente encontrado en las muestras de medicamentos, alimentos y otros productos por lo que es muy fácil que las muestras en estudio se contaminen en el laboratorio por manipulación incorrecta y con ello se lleguen a conclusiones erróneas sobre la pureza de la muestra en cuestión. Cuando se quiere comprobar que un producto está libre de pirógenos se realiza el ensayo de LAL o prueba LAL ya que se ha demostrado que a pesar del ensayo de pirógenos en conejos ser sensible a otros pirógenos diferentes a las endotoxinas, no se obtienen resultados positivos sin que de positivo el ensayo de LAL y por el contrario se ha visto que muestras contaminadas por endotoxinas en pequeñas cantidades pueden dar negativo el ensayo de conejos y mediante el método de LAL se puede llegar a cuantificar la cantidad de endotoxinas presentes. Por estas características el ensayo de LAL se ha impuesto tanto en la industria, como en los laboratorios donde se realizan investigaciones como el mejor método para la determinación de pirógenos.

Para realizar el ensayo LAL se precisa de un patrón de endotoxina, que hay que manipular con cuidados extremos al estar el agente infeccioso en una alta concentración en la disolución de referencia. Por lo que el primer riesgo a considerar es sobre la salud de la persona que lleve a cabo el ensayo y los que pueden estar compartiendo el espacio de trabajo. La endotoxina estándar de referencia debe ser tratada según las instrucciones que acompañen el envase para evitar errores a la hora de hacer la curva de calibración.

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Antes de comenzar el análisis de las muestras mediante LAL se deben medir por cuatriplicado cada una de las disoluciones con que se construye la curva patrón y con el análisis estadístico de estas disoluciones preparadas el operario quedará cualificado para realizar el ensayo. Uno de los puntos a tener en cuenta es que las muestras que van a ser sometidas al ensayo de LAL deben ser pasteurizadas o liofilizadas para su conservación y nunca congeladas, debido a que la congelación provoca pérdida de endotoxinas que son las responsables de que se produzca la coagulación de la hemolinfa del cangrejo Limulus Polyphemus y se obtenga una señal medible proporcional a la cantidad de endotoxinas presentes.

Todo el instrumental que va a ser utilizado para el ensayo de determinación de endotoxinas debe ser primeramente despirogenado, para lo cual se puede utilizar alguno de los métodos validados para este fin. El método más común para despirogenar el material de laboratorio es el tratamiento con aire seco y caliente, como las endotoxinas son resistentes al calor deben usarse temperaturas mayores de 250ºC y comprobar que realmente el material quede libre de pirógenos. Se ha reportado que con temperaturas menores y mayor tiempo de exposición al calor el instrumental también queda apirógeno, por ejemplo a 180ºC por calentando durante 3 horas. Existen autores que consideran que puede utilizarse la autoclave para el despirogenado o la hidrólisis ácido base, debido a que al lavar el material con una disolución ácida o usar álcali se provoca la ruptura del complejo lípido A - proteína que forma la endotoxina. No obstante se ha comprobado que estos métodos presentan menos efectividad que el uso de aire seco caliente.

Existen otros métodos para despirogenar disoluciones o muestras que van a utilizarse en las investigaciones con fármacos u otros productos que requieran que el investigador se asegure que se encuentran libres de endotoxinas. Algunos de estos métodos son:

• la ultrafiltración, donde al pasar la muestra por un filtro ultrafino se evita el paso de moléculas grandes como son los lipopolisacáridos

• la cromatografía de intercambio iónico, en la que se aprovecha el hecho de que las endotoxinas presentan una carga negativa para que se queden retenidas en la columna, pero su eficacia depende del pH, la velocidad de elución de la columna y otros factores que hacen poco fiable el método

• la ósmosis reversa o la destilación.

Hay que tener en cuenta que el material que se compra estéril en muchas ocasiones hay que prepararlo para el test de LAL, antes de usarlo. Por eso se recomienda el uso de viales y demás cristaleria específica para la determinación de endotoxinas como son las puntas de pipeta y los tubos para la reacción gel clot que ofrece la división LAL de Wako en sus catálogos, pertenecientes a la serie BioClean®. No es aconsejable reutilizar el material que se ha usado en un ensayo de LAL para futuras determinaciones, así como el resto del material de laboratorio que después de lavado puede contener residuos químicos o biológicos que enmascaren las endotoxinas y conduzcan a falsos resultados del test de LAL.

En el ensayo de LAL se deben tomar otras precauciones como dejar secar los viales al menos una noche si la endotoxina se aplica directamente en el fondo de los mismos para medir la curva patrón y realizar este procedimiento bajo una cabina con corriente de aire unidireccional. Realizar el ensayo de LAL a todos los productos de partida, así como el agua y la cristalería es importante en los casos en que se observa contaminación de muestras por endotoxinas en el producto final. Además cada vez que se compre el reactivo de LAL se debe comprobar su sensibilidad con el patrón de endotoxina estándar y con ello asegurarnos de que se están realizando las medidas correctamente.

Por todo lo que hemos comentado se recomienda a los investigadores y técnicos encargados de realizar este ensayo que trabajen con reactivos de calidad y cuyo uso no requiera de material adicional de laboratorio. Estas características las cumplen los kits que comercializa la división LAL de Wako, que funcionan mediante los tres métodos de detección empleados en el ensayo de LAL, colorimétrico, turbidimétrico y gelificación.

Bibliografía

1) Novitsky, T. J., Oceanus, 27(1), 13-18, 1991.

2) Tsuji, K. et al., App. and Env. Microbial, 36, 705-719, 1978.

3) Sandle, T., American Pharm. Reviews, epub 28 octubre, 2013.

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