Interferentes en el ensayo de LAL

El ensayo de lisado de amebocitos de Limulus, conocido por sus siglas como LAL, sirve para determinar la presencia de endotoxinas bacterianas provenientes de la pared celular de las bacterias Gram negativas. El ensayo de LAL se puede llevar a cabo a partir del descubrimiento, desde hace más de seis décadas, de que la sangre del cangrejo herradura, Limulus Polyphemus, se coagula en presencia de las endotoxinas bacterianas. Los lipopolisacáridos que son las especies químicas consideradas tóxicas al producirse la lisis celular de las bacterias Gram negativas, activan una serie de reacciones en cascada que se producen en la hemolinfa del cangrejo herradura, provocando finalmente una turbidez en la muestra; siendo esta la señal analítica utilizada para el desarrollo del ensayo de LAL.

No obstante existen otros factores que provocan que aparezca turbidez en una muestra que contenga un lisado de amebocitos de Limulus, ya sea porque activan la misma serie de reacciones que las endotoxinas u otra vía que también provoque la formación de la coagulina, proteína causante de la formación del gel, que provoca que aparezca la turbidez en la disolución, al sufrir el proceso de coagulación.

Entre los factores que interfieren en la detección de endotoxinas mediante el ensayo de LAL se encuentran:

• El pH, que debe ajustarse entre 6,4 y 8. En el caso de usarse los test comerciales se deben leer detenidamente las indicaciones del fabricante y aunque en la mayoría de los casos ya tienen alguna sustancia que actúa como tampón incluida, comprobar que el pH se encuentra en los valores indicados.

• La fuerza iónica del medio también es un factor a considerar, en disoluciones con alta concentración de iones ocurren procesos de agregación entre las moléculas de lipopolisacáridos que hacen que se determine una cantidad de endotoxinas menor que la real.

• Interferencias debidas a la presencia de sustancias orgánicas con propiedades quelantes o anticoagulantes, que impiden la formación del gel indicativa de la cantidad de endotoxinas, un ejemplo de este tipo de sustancia es la heparina.

• Oxidantes u otro tipo de compuesto capaces de desnaturalizar las enzimas necesarias para que ocurra toda la cascada de reacciones que da lugar a la formación del gel de coagulina, o cualquier sustancia que inhiba la acción de estas enzimas.

• Interferentes que mimetizan la acción de las endotoxinas como pueden ser las serina proteasas, los (1→3)-ß-D-glucanos, los filtros celulósicos, entre otros.

DESTACADO: La determinación de endotoxinas bacterianas: ¿cómo evitar la contaminación de las muestras durante la manipulación?

En los casos en que el ensayo LAL se lleva a cabo usando el método de detección cromogénico cualquier factor que interfiera en la medición del color de la muestra también es considerado un interferente en el análisis. Lo más común en estos casos es que la muestra a analizar contenga algún compuesto coloreado que absorba en la zona del espectro donde tenga la banda de absorción el colorante utilizado en la medida.

El test que ha desarrollado Wako para efectuar la determinación de endotoxinas por el método colorimétrico es el Limulus Color KY, que se vende como un kit para un solo ensayo o múltiples ensayos. Se basa en un procedimiento cinético cromogénico, puesto que el desarrollo del color es proporcional a la cantidad de endotoxinas presentes en la muestra. La medida del color puede realizarse con un lector de placas o un lector de tubos, teniendo como límite de detección 0.0002 UE/mL (el que contiene un solo ensayo) y 0.0005 UE/mL (el que contiene múltiples ensayos).

La interferencia de las proteasas y otras enzimas que contenga la muestra puede eliminarse mediante el calentamiento, la de los (1→3)-ß-D-glucanos, se puede combatir estudiando los contaminantes que provoquen la presencia de estos compuestos en la muestra para erradicarlos, o mediante otros métodos. Esta interferencia se produce porque los (1→3)-ß-D-glucanos interaccionan con el factor enzimático G que interviene en la cascada de reacciones para la formación del gel de coagulina.

Los test que vende la división LAL de la compañía Wako contienen glucanos añadidos, en forma de curdlan carboximetilado, en la mezcla de reactivos necesarios para el análisis. Al adicionar el derivado de curdlan el proceso de gelificación se hace insensible a la presencia de (1→3)-ß-D-glucanos, y esta característica es la que ha sido aprovechada en los kits de la serie Pyrostar para eliminar esta interferencia.

Además de los kits para determinar la presencia de endotoxinas por los diferentes métodos, Wako vende una serie de accesorios y reactivos útiles para realizar estos ensayos, como son los tubos con tapa de aluminio (Limulus Test Tube-S with Aluminum Cap), el agua destilada libre de endotoxinas (LRW) o la endotoxina estándar de control (CSE).

Bibliografía:

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2) Ketcchum PA, Parsonnet J, Stotts LS, Nocvitsky TJ, Scchlain B, Bates DW., J Endotox Res., 4(1), 9-16., 1997.

3) J. Kambayashi, M. Yokota, M. Sakon, E. Shiba, T. Kawasaki, T. Mori, M. Tsuchiya, H. Oishi, S. Matsuura, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 22, 2, 93-100, 1991.

ACCESORIOS Y REACTIVOS LAL

Ensayo simple de Limulus PS	PYROSTAR™ ES-F Prueba vial única	Solución extractora de endotoxina