Extracción y cuantificación de endotoxinas bacterianas
Las endotoxinas son moléculas lipopolisacáridas que se encuentran en la membrana exterior de las bacterias gramnegativas. Las endotoxinas que entran en el cuerpo humano pueden provocar una reacción inflamatoria peligrosa. Por esta razón, las directrices de la FDA imponen límites estrictos en los niveles de endotoxinas en los extractos de dispositivos médicos. Los dispositivos que entran en contacto con el sistema cardiovascular o linfático deben estar por debajo de 0,5 EU/ml, mientras que los que entran en contacto con fluido cerebroespinal deben estar por debajo de 0,6 EU/ml.
El test de lisado de Amebocito Límulus (LAL) es el método más popular para ensayar los niveles de endotoxinas. Este método utiliza lisado de amebocito del cangrejo herradura del Atlántico, en el que la presencia de endotoxinas desencadena un mecanismo de defensa que induce la coagulación. El ensayo LAL se usa comúnmente en muchos sectores, como los fármacos, dispositivos médicos, hospitales y laboratorios de investigación.
La solución de muestra utilizada con los ensayos LAL puede tener un impacto considerable en la eficiencia de la reacción de endotoxinas. Generalmente, las soluciones de muestra están preparadas en agua. Sin embargo, los estudios han determinado que puede haber otras sustancias presentes en estas soluciones que pueden interferir con la reacción de coagulación de LAL. Fuentes comunes de interferencias incluyen los metales, aminoácidos, antibióticos y enzimas.
La solución de extracción de endotoxinas, fabricada por FUJIFILM Wako, permite la extracción de endotoxinas que no se pueden extraer en agua o solución salina. La solución está especialmente recomendada para dispositivos médicos que pueden entrar en contacto con fluidos que contienen sangre o proteínas. Un kit incluye cuatro viales de 10 ml.
La solución de extracción es sencilla y fácil de usar: diluya un único vial del producto 1:20 en agua sin endotoxinas y añádalo a la muestra o sumerja la muestra en la misma. Tras una agitación suave y una incubación de una hora a temperatura ambiente, la endotoxina extraída puede medirse.
Tras la extracción, Limulus Color KY Series proporciona un método robusto para cuantificar los niveles de endotoxinas. La presencia de endotoxinas desencadena una cascada de desarrollo del color en la que se activan varios precursores de serín proteasas. En la última reacción, la encima coaguladora hidroliza el sustrato cromogénico para liberar el cromógeno amarillo.
El kit depende del ensayo cinético cromogénico, que supervisa el tiempo de absorción para alcanzar un valor de umbral conocido como tiempo de activación (Ta). Medir el Ta para muestras de endotoxinas conocidas nos permite preparar la curva estándar que permite determinar, a partir del Ta, la concentración de endotoxinas de una muestra desconocida.
El kit Limulus Color KY es muy sensible, con un límite de detección cuantitativo de 0,0002 EU/ml (tipo único) o 0,0005 EU/ml (tipo múltiple). Adicionalmente, dado que se sabe que un hongo polisacárido conocido como (1→3)-β-D-glucano activa el LAL, el reactivo contiene un gran nivel de (1→3)-β-D-glucano, y por lo tanto se inhiben sus efectos. Esto permite que las endotoxinas se detecten con una gran especificidad, evitando así los falsos positivos.
El kit Limulus Color KY es compatible con el formato del lector de tubos Toxinometer® o un lector de microplacas. Está disponible como kit de ensayo único o multi-ensayo y se puede comprar con endotoxinas estándar de control (CSE). CSE contiene endotoxinas liofilizadas purificadas de la cepa UKT-B de E. coli y se puede usar como estándar para los ensayos de LAL.
ALGUNOS ACCESORIOS LAL:
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| Puntas de pipeta sin endotoxinas BioClean® Series | Placas Wako BioClean® | Agua reactivo LAL (LRW): Agua sin endotoxina |