Evolución de la prueba BET a lo largo del tiempo y posibilidades futuras en el campo de las pruebas de endotoxinas

Published on 24th June 2024

Los pirógenos, incluidos los lipopolisacáridos (LPS) de las bacterias Gram negativas (endotoxinas), son sustancias que pueden causar fiebre y se consideran contaminantes peligrosos en los productos para la salud. La interacción directa de los productos médicos con la sangre y los órganos tiene el potencial de desencadenar pirógenos, que activan la inmunidad innata del organismo. Esto puede provocar fiebre alta, inflamación, daño tisular y riesgo de sepsis y estado de shock.[1]

Por lo tanto, para cumplir con los requisitos regulatorios, los productos médicos se someten a pruebas de pirogenicidad como parte de las normas y especificaciones de calidad establecidas por la Farmacopea.[1]

Antecedentes históricos de la pirogenicidad

Burdon-Sanderson acuñó el término “pirógeno” en 1875 para describir una sustancia hipotética encontrada en extractos de carne en descomposición sin bacterias que inducía fiebre en los animales cuando se inyectaba. El descubrimiento de Wechselman en 1911, de que las inyecciones de Salvarsan (un fármaco contra la sífilis) provocaban fiebre en los pacientes debido a las bacterias presentes en el agua destilada, llevó a buscar una solución. Sin embargo, el fármaco debía inyectarse y no podía tomarse por vía oral. Este fármaco hizo que los medicamentos inyectables se volvieran comunes y que el control de pirógenos fuera esencial.[2].

Análisis de pirógenos

Prueba de pirógenos en conejos (RPT)

La primera prueba de pirógenos en conejos fue desarrollada por Hort y Penfeld en 1912, y reveló que las bacterias Gram negativas causaban efectos pirogénicos significativos en los conejos, mientras que las bacterias Gram positivas tenían efectos mucho más leves.[2].

En este estudio se administran endotoxinas a conejos y se hace un seguimiento de la aparición de reacciones febriles caracterizadas por una elevación de la temperatura corporal. No obstante, la reacción podría diferir de la del cuerpo humano, lo que podría dar lugar a conclusiones inexactas.

Ensayo de Lisado de amebocitos de Limulus (LAL)

El ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL), también conocido como test de endotoxinas bacterianas (BET), se utiliza como sustituto. Este método de ensayo es rentable y ampliamente reconocido. La prueba LAL consiste en mezclar sangre de Limulus con endotoxina bacteriana para formar un coágulo gelatinoso denominado lisado. Los kits de prueba de pirógenos actuales utilizan las propiedades turbidimétricas de este lisado para realizar las pruebas. La prueba LAL ha demostrado ser 5 veces más sensible que la prueba del conejo para la detección de pirógenos.[3]

La prueba de LAL para radiofármacos se modifica con solución de cloruro cálcico para evitar resultados imprecisos debidos a agentes quelantes. La presencia de estos agentes reduce la concentración de iones de calcio divalentes libres en el reactivo de LAL, lo que inhibe la formación de gel de coagulina y podría dar lugar a un resultado falso negativo. Esta adaptación modificada del método de ensayo de LAL se utiliza actualmente en hospitales y radiofarmacias centrales para las pruebas de control de calidad de radiofármacos y kits fríos[4]. 

La técnica MAT (Test de activación de monocitos)

El MAT se usa principalmente para identificar y cuantificar contaminantes pirogénicos con endotoxinas y no endotoxinas. La activación de monocitos humanos puede ocurrir debido a estos contaminantes, resultando en la liberación de mediadores naturales[5]. El MAT implica la exposición de células monocíticas humanas a pirógenos in vitro, lo que activa las células. Esta activación desencadena la liberación de citocinas proinflamatorias, que posteriormente se cuantifican mediante la técnica ELISA[6].

El MAT es más relevante fisiológicamente porque utiliza células humanas. Además, este sistema de detección puede identificar y medir pirógenos tanto endotoxinas como no endotoxinas con precisión cuantitativa [7].

Perspectivas de futuro

La transición de los ensayos RPT a los MAT ha sido todo un reto y ha requerido un inmenso esfuerzo y dedicación. La Dirección Europea de Calidad de Medicamentos y Asistencia Sanitaria, el Consejo de Europa y la European Partnership for Alternative Approaches to Animal Testing organizaron conjuntamente una conferencia internacional titulada “El futuro de las pruebas de pirogenicidad: eliminación progresiva de la prueba de pirógenos en conejos”. La conferencia puso de relieve la misión de la Farmacopea Europea de eliminar el RPT de sus textos para 2026, hacer más eficiente la adopción de los MAT y señalar cualquier brecha en la erradicación del RPT

Para cumplir las directivas de la FDA, es esencial realizar una validación específica del producto para evaluar la idoneidad de utilizar la técnica MAT para evaluar una sustancia o material de prueba en particular. El proceso de validación debe abarcar diversas pruebas, como pruebas de interferencia y detección precisa de pirógenos en cada muestra, garantizando al mismo tiempo el contacto directo entre el dispositivo y los monocitos

Referencias

  1. Spoladore, J., et al., Standardized pyrogen testing of medical products with the bacterial endotoxin test (BET) as a substitute for rabbit Pyrogen testing (RPT): A scoping review. Toxicol In Vitro, 2021. 74: p. 105160.
  2. Hartung, T., The human whole blood pyrogen test – lessons learned in twenty years. ALTEX - Alternatives to animal experimentation, 2015. 32(2): p. 79-100.
  3. Karesh, S.M.J.J.o.n.m.t., Sterility and pyrogen testing of radiopharmaceuticals. 1989. 17(3): p. 156-159.
  4. Mitra, A., et al., Limulus amebocyte lysate testing: adapting it for determination of bacterial endotoxin in 99mTc-labeled radiopharmaceuticals at a hospital radiopharmacy. J Nucl Med Technol, 2014. 42(4): p. 278-82.
  5. Solati, S., T. Zhang, and S. Timman, The monocyte activation test detects potentiated cytokine release resulting from the synergistic effect of endotoxin and non-endotoxin pyrogens. Innate Immun, 2022. 28(3-4): p. 130-137.
  6. Perdomo-Morales, R., et al., Monocyte activation test (MAT) reliably detects pyrogens in parenteral formulations of human serum albumin. Altex, 2011. 28(3): p. 227-35.
  7. Carson, D., et al., Development of a Monocyte Activation Test as an Alternative to the Rabbit Pyrogen Test for Mono- and Multi-Component Shigella GMMA-Based Vaccines. 2021. 9(7): p. 1375.
  8. Cirefice, G., et al., The future of pyrogenicity testing: Phasing out the rabbit pyrogen test. A meeting report. Biologicals, 2023. 84: p. 101702.
  9. Sandle, T., FDA guidance on pyrogens and endotoxin testing.