Estrategias para medir Endotoxinas en muestras difíciles

La contaminación por endotoxinas de los productos terapéuticos parenterales puede tener consecuencias graves, como, por ej., fiebre, sepsis y shock séptico. Por lo tanto, las pruebas de endotoxinas se han establecido como un componente rutinario y crítico de la fabricación y el control de calidad de productos farmacéuticos parenterales y dispositivos médicos.

El ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) es la prueba mejor establecida para la evaluación de endotoxinas.¹ Se basa en la incubación de un extracto de amebocitos del cangrejo herradura con una muestra examinada para detectar contaminación por endotoxinas. Si la endotoxina está presente en la muestra analizada, se forma un coágulo. La técnica de ensayo LAL más tradicional es el ensayo cualitativo de coágulo de gel. Posteriormente, se desarrollaron versiones cuantitativas del ensayo LAL, incluidos los ensayos LAL cromogénico y turbidimétrico.

Se ha confirmado la precisión y fiabilidad del ensayo LAL. Sin embargo, una variedad de factores relacionados con los productos analizados, los componentes de la mezcla de ensayo, el medio ambiente e incluso los contenedores pueden provocar desafíos en las pruebas y resultados engañosos, incluida la interferencia de la muestra o el enmascaramiento de endotoxinas.^2–4  Entre los factores que pueden interferir con el desempeño adecuado del ensayo LAL se encuentran inhibidores químicos (como, por ej.) el ácido etilendiaminotetraacético, EDTA); agentes desnaturalizantes (tales como ácidos concentrados, bases, sales inorgánicas o solventes orgánicos); moléculas de alcohol base; un valor de pH fuera del rango óptimo; enmascaramiento de endotoxinas (mediante sustancias tales como excipientes, tensioactivos, quelantes u óxido de N-dimetilamina); o absorción de la endotoxina en las superficies de los envases.¹ Para los dispositivos médicos, el recubrimiento anticoagulante, el contenido de metales pesados ​​o la presencia de partículas pueden interferir con los resultados de la prueba.² Para los productos evaluados con el método cromogénico, analice los componentes de la mezcla que adquieren un color específico cuando entran en contacto con el reactivo LAL ya que también podrían interferir con los resultados de la prueba.¹ Para las muestras examinadas con el método turbidimétrico, los productos turbios o suspendidos también pueden provocar interferencias en la muestra.¹ 

Se han desarrollado varias estrategias para mitigar la influencia de los factores que causan la interferencia de la muestra o el enmascaramiento de endotoxinas:

1. Dilución adecuada de la muestra: si no hay una actividad que interfiera o aumente la concentración en el ensayo LAL, se recomienda examinar los productos sin diluir. Sin embargo, si los ingredientes del producto interfieren con el ensayo LAL, el producto debe diluirse para superar la interferencia o el aumento. Se recomienda identificar la dilución más baja del producto que neutralizaría el efecto de interferencia pero aún permitiría la determinación de endotoxinas.2

2. La digestión, la adición de tampones, la filtración o la centrifugación son otros posibles tratamientos para mitigar la interferencia de la prueba para dispositivos médicos.² Su implementación debe basarse en una evaluación cuidadosa de los factores de interferencia y la validación de las condiciones de la prueba.

3. Mantener un rango de pH óptimo: el rango de pH óptimo para el ensayo LAL está entre 6,0 y 8,0, y las condiciones de la prueba deben mantenerse dentro de este rango para garantizar resultados uniformes.

4. Garantizar la homogeneidad de la muestra: las muestras en suspensión pueden causar problemas de interferencia. Por lo tanto, se debe hacer un esfuerzo para asegurar la homogeneidad de la muestra. En este contexto, no se recomienda agrupar muestras de diferentes etapas del proceso de fabricación, ya que puede ser difícil asegurar su homogeneidad.²

5. Ajuste de la dilución válida máxima (MVD) para muestras agrupadas: en ciertos casos, las unidades de pequeño volumen del producto farmacéutico terminado pueden agruparse en una muestra compuesta para un análisis de ensayo LAL. En tales casos, el MVD debe ajustarse a un valor proporcional más bajo dividiendo el MVD calculado para una muestra individual por el número total de muestras agrupadas.²

6. Uso de kits y envases de muestra bien caracterizados por su desempeño en el ensayo LAL: dado que los componentes de la mezcla del ensayo LAL y los recipientes de muestra también pueden afectar negativamente los resultados de la prueba,⁴ solo se deben usar kits de prueba y recipientes de muestra bien caracterizados.

Referencias

1. Wheeler, A. Comparing endotoxin detection methods. Pharmaceutical Technology 2017;41:58–62.
2. FDA. Guidance for industry: pyrogen and endotoxins testing: questions and answers. June 2012.
3. Reich J, Lang P, Grallert H, Motschmann H. Masking of endotoxin in surfactant samples: Effects on Limulus-based detection systems. Biologicals. 2016;44(5):417-22. doi: 10.1016/j.biologicals.2016.04.012.
4. Bech Ørving R, Carpenter B, Roth S, Reich J, Kallipolitis B, Sonne-Hansen J. Bacterial Endotoxin Testing-Fast Endotoxin Masking Kinetics in the Presence of Lauryldimethylamine Oxide. Microorganisms. 2020;8(11):1728. doi: 10.3390/microorganisms8111728.