Ensayos de Betaglucanos y Endotoxinas
Mediante el ensayo de LAL (Lisado de amebocitos de Límulus) se puede determinar la presencia de endotoxinas bacterianas en diferentes medios, soluciones y material de laboratorio. Este ensayo, que es el ensayo de compendio para el análisis de endotoxinas bacterianas en productos farmacéuticos, se ha convertido en una herramienta esencial para la industria y la investigación en las últimas décadas, y en el ensayo más fiable para la detección de pirógenos.
El análisis bioquímico del ensayo LAL utiliza un mecanismo de coagulación único iniciado por los amebocitos de la sangre del cangrejo herradura del Atlántico (Limulus polyphemus) cuando se exponen a las endotoxinas bacterianas gramnegativas. Existe una cascada especial asociada con LAL que hace que sea posible observar efectos cualitativos o cuantitativos cuando las endotoxinas están presentes. Las reacciones enzimáticas que se producen a lo largo de esta cascada dan lugar a la conversión del coagulógeno amebocitario en una proteína de coagulación similar al brinógeno, que forma un gel de coagulina.1 Una revisión más detallada de estas reacciones muestra que la interacción con endotoxinas inicia el Factor C (primer precursor de la serina proteasa) desde su forma inactivada, que a su vez activa el Factor B (segundo precursor de la serina proteasa). El factor B activado estimula la enzima coagulante, convirtiéndola en una enzima procoagulante.
La enzima coagulante escinde los enlaces peptídicos dentro del coagulógeno para producir coagulina: la proteína formadora de gel insoluble producida en el ensayo de gel-clot. Pero existen otros compuestos que también provocan la gelificación en el lisado de amebocitos del cangrejo herradura, provocando interferencias en el ensayo de endotoxinas bacterianas. Algunos de estos compuestos son (1,3)-β-D-glucanos, los cuales causan falsos positivos en el ensayo de LAL debido al inicio de la cascada de coagulación cuando los glucanos activan la enzima proteasa Factor G. Para resolver esta interferencia, el ensayo puede modificarse para incluir una amplia gama de reactivos bloqueadores de glucanos.
Los (1,3)-β-D-glucanos son compuestos polisacáridos constituidos por monómeros de glucosa, específicamente monómeros de D-glucosa unidos a través de enlaces β-glicosídicos, que son producidos por muchos organismos procariotas y eucariotas. Una de las principales fuentes de contaminación de glucanos en los laboratorios proviene de la celulosa del papel, pues estos compuestos se encuentran en la pared celular de las células de los árboles. Dado que las operaciones de filtración son un proceso habitual en la mayoría de los laboratorios y se realizan en muchas ocasiones utilizando papel de filtro de celulosa, no es extraño encontrar que las muestras que se analizan para detectar la presencia de endotoxinas bacterianas contengan (1,3)-β-D-glucanos introducidos por las fibras de estos mismos filtros. En muchos casos, no se llega a realizar un examen completo de los filtros antes del ensayo, lo cual permite la lixiviación de los glucanos de ciertos tipos que finalmente terminan en el filtrado. A menudo, este problema sólo se detecta mediante pruebas rutinarias realizadas en el producto terminado utilizando el ensayo LAL. Las muestras también pueden estar contaminadas por el contacto con otros organismos productores de glucanos. Los glucanos contaminantes pueden provenir de diferentes fuentes como el zimosano de las levaduras, la laminarina de las algas, el lentinan de las setas shiitake (a menudo usado como fármaco antitumoral) y el curdlan que producen las bacterias.
Los β-glucanos también se han considerado patógenos en los mamíferos y, por lo tanto, una grave preocupación de posible contaminación tanto en el bioprocesamiento como en los productos sanguíneos. Los β-glucanos en cantidades elevadas en los productos finales farmacéuticos pueden provocar una respuesta inmunitaria, por lo que es necesario controlar sus niveles para evitar que se produzcan reacciones asociadas entre el público en general. Los β-D-glucanos, los cuales tienen diferentes efectos en mamíferos, son mediadores de la respuesta inmunitaria al activar diferentes receptores de la respuesta proinflamatoria, como aquellos que encontramos en los linfocitos, macrófagos y en la cascada del complemento. Generalmente, no se digieren en el intestino. Son sustancias que sirven como fuente de energía a los diferentes microorganismos que habitan en el tracto gastrointestinal a través de la fermentación. Estas moléculas se han utilizado como método de diagnóstico de infecciones por hongos en humanos, como aditivo alimentario por sus propiedades como prebióticos y como inmunomoduladores. Se han realizado estudios para su uso como posibles fármacos por sus efectos anticancerígenos y como reductores del colesterol, gracias a su capacidad para evitar la absorción del colesterol de la comida en el estómago y los intestinos. Algunos de los β-glucanos más estudiados son el paramilo, procedente de la Euglena gracilis y el curdlan, proveniente de la Alcaligenes faecalis, para el que se ha propuesto una estructura de triple hélice.
En la práctica, es frecuente que el investigador o técnico necesite conocer la concentración de endotoxinas bacterianas sin la interferencia de los glucanos. Esto sucede sobre todo cuando el ensayo de LAL se usa como método de detección de pirógenos, ya que los glucanos en general son sustancias que no causan fiebre.
Esto puede tener especial importancia en los procesos asociados con el tratamiento de la hemodiálisis. Los pacientes que se someten a l hemodiálisis convencional tres veces a la semana suelen estar expuestos a entre 300 y 600 litros de agua dependiendo de su prescripción (Coulliette, 2013), siendo el agua más del 90 % del dialisato (Layman-Amato, 2013). Por lo tanto, la presencia de contaminación por bacterias gramnegativas o endotoxinas asociadas, ya sea en el agua de diálisis o en el propio dialisato, puede poner en peligro la vida y la salud del paciente. La presencia de microorganismos bacterianos en estos líquidos puede provocar una inflamación crónica, que a su vez podría contribuir a la aparición de enfermedades cardiovasculares: la principal causa de muerte de los pacientes en diálisis. Por otro lado, los fragmentos de endotoxinas en el baño de dialisato pueden atravesar las membranas del dializador y causar síntomas de septicemia o una reacción pirogénica (Coulliette, 2013). Dado que la fuente de agua utilizada en la hemodiálisis consiste básicamente en agua potable que ha pasado por varios niveles de purificación, poder controlar con precisión su calidad es un aspecto vital del tratamiento de la hemodiálisis.2
Al considerar a los receptores de trasplantes de órganos o de células madre que suelen ser tratados con fármacos inmunosupresores, se ha demostrado que las infecciones fúngicas invasivas provocan un nivel significativo de morbilidad y mortalidad, y se ha demostrado que la determinación de los niveles de β-D-glucano es una herramienta útil para el diagnóstico presuntivo de este tipo de infecciones.3
Al intentar comprobar la presencia de glucanos, hay tres métodos generalmente reconocidos que se utilizan de forma rutinaria en la industria hoy en día: el método de hidrólisis de base, el método de sustracción o la medición directa.
Al utilizar la hidrólisis de base, se añade hidróxido de sodio a la muestra de ensayo, que se mantiene a 37 °C durante 12-15 horas para destruir cualquier endotoxina que pueda estar presente. Tras ajustar el pH de la mezcla con HCL, la muestra se puede analizar. Si el ensayo LAL posterior muestra un resultado positivo, indicaría que hay glucanos y no endotoxinas.
Con el método de sustracción, se utilizan dos ensayos diferentes para la determinación de endotoxinas. Uno de los ensayos incorporará un lisado que sea inherentemente específico de endotoxinas o que haya sido tratado con un bloqueador de glucano disponible en el mercado que haga que el reactivo no reaccione a la interferencia del (1,3)-β-D-glucano al bloquear eficazmente la vía del Factor G de la cascada de coagulación de la endotoxina. El otro ensayo utiliza un producto de lisado no tratado o no modificado. La diferencia entre los dos resultados es proporcional a la cantidad de endotoxinas presentes en la muestra.
El método de medición directa, como su nombre indica, es una determinación específica y cuantitativa de los (1,3)-β-D-glucanos mediante métodos que inactivan las endotoxinas, como el uso de un detergente no iónico y polimixina B o de un ensayo de anticuerpos monoclonales especialmente diseñado contra el Factor C activado.1
Independientemente del método de ensayo utilizado, la investigación de los β-glucanos sigue siendo importante para los científicos farmacéuticos de todo el mundo, tanto desde una perspectiva clínica como de fabricación. A diferencia de las endotoxinas bacterianas, los niveles de contaminantes de (1,3)-β-D-glucano en los productos farmacéuticos no están actualmente regulados y no existe ninguna norma compendiada para su detección. Además, no existe un enfoque totalmente homogéneo que permita
determinar niveles aceptables. No obstante, existe una tendencia creciente en la industria y entre las autoridades reguladoras de todo el mundo de detectar y cuantificar los (1,3)-β-D-glucanos, y de conocer sus verdaderos niveles de seguridad.4
La relevancia de los β-glucanos como herramientas en la determinación de las infecciones fúngicas, como contaminantes problemáticos en los procesos de fabricación de productos farmacéuticos y como posibles ingredientes activos en los medicamentos actuales y futuros, ha colocado a este diverso grupo de polisacáridos en una categoría única que justifica una mayor investigación. Para los ensayos de rutina en el laboratorio de control de calidad, sigue siendo de vital importancia establecer un método de ensayo fiable y reproducible para poder examinar cualquier reacción y determinar si la causa se debe efectivamente a las endotoxinas o a la presencia de (1,3)-β-D-glucanos.1
Referencias:
1. Sandle, T. PhD., "Pharmaceutical Product Impurities: Considering Beta Glucans", American Pharmaceutical Review. 31 de agosto de 2013, adición en línea
2. "Dialysate Water System Microbiology & Endotoxin Sampling", Provincial Standards and Guidelines, agosto de 2016; BCPRA Hemodialysis Committee
3. Theel, E.S. y Doern, C.D. "β-d-Glucan Testing Is Important for Diagnosis of Invasive Fungal Infections", J Clin Microbiol. Noviembre de 2013; 51(11): 3478-3483.
4. Neun, B.W., Cedrone, E., Potter, T.M., Crist, R.M. y Dobrovolskaia, M.A., "Detection of Beta- Glucan Contamination in Nanotechnology- Based Formulations", Molecules. Agosto de 2020; 25(15): 3367, publicado en línea el 24 de julio de 2020. doi: 10.3390/molecules25153367
Sobre la autora:
Lisa Komski, Directora general de ventas LAL
Lisa Komski es la Directora general de ventas de la División LAL de FUJIFILM Wako Chemicals U.S.A. Corporation. Con una carrera profesional de casi 30 años en los sectores de la química y la biotecnología, se ha consolidado como una excelente profesional del desarrollo de negocios, con un gran enfoque en el servicio al cliente. De pequeña soñaba con ser doctora, por lo que tener la oportunidad de gestionar la línea PYROSTARTM durante los últimos 6 años le ha permitido participar en una empresa dinámica que apoya esta pasión para ayudar a proteger la salud y la seguridad de los demás. Lisa cuenta con una licenciatura en Biología y Tecnología Médica y también habla con fluidez tanto el inglés como el español. Cuando tiene tiempo libre, a Lisa le gusta pasar tiempo con su familia, sus amigos, viajar al extranjero y mimar a su adorable nieto.
