Ensayo LAL: precauciones al investigar en fármacos

Desde hace varias décadas se ha comprobado que el método más efectivo para la determinación de pirógenos en muestras de fármacos, independientemente de la forma de presentación del principio activo, es el ensayo de LAL (Lisado de amebocitos de Limulus). Mediante el ensayo de LAL se determina la presencia de endotoxinas bacterianas, moléculas de lipopolisacáridos (LPS) que forman parte de la pared celular de las bacterias Gram negativas y que son el más frecuente, y además el más peligroso, de los pirógenos presentes en los productos de la industria farmacéutica.

El método de LAL surgió como un ensayo cualitativo de presencia de endotoxinas. El gel formado producto de la coagulación de la hemolinfa del cangrejo herradura cuando entra en contacto con LPS, sirvió como señal analítica a los investigadores que desarrollaron el método. Con el paso de los años se amplió la utilidad del ensayo de LAL, con la aparición de diferentes maneras de realizar la medida de manera cuantitativa. Actualmente ya se pueden adquirir los kits para llevar a cabo el ensayo usando métodos de detección como el colorimétrico y el turbidimétrico. Ejemplo de estos kits son los que distribuye la compañía Wako a través de su línea PYROSTAR™, como el Kit KY Color de Limulus y el PYROSTAR™ ES-F/Plate.

Para realizar el ensayo de LAL, y que el error en el índice de recuperación de endotoxina sea mínimo, se deben tener en cuenta varias precauciones. Algo de gran importancia a tener presente es la ubicuidad de las bacterias Gram negativas, que se pueden encontrar casi en cualquier medio, por lo que son diversas las fuentes de contaminación a las que están expuestas las muestras de fármacos. Las endotoxinas bacterianas pueden proceder tanto del personal y el equipamiento en contacto con las muestras, como del ambiente o de las materias primas usadas en los procesos de fabricación. En los laboratorios de investigación, donde en muchas ocasiones se tienen abiertas diferentes líneas de estudio, puede existir contaminación cruzada en las neveras donde se almacenan las muestras, las mesadas de trabajo o el instrumental de laboratorio. Para minimizar los riesgos de este tipo de contaminación se pueden comprar para el ensayo de LAL utensilios y reactivos libres de endotoxinas bacterianas, por ejemplo agua destilada libre de endotoxinas.

También se debe recordar que según el tipo de bacteria de la que procede la endotoxina, la molécula de LPS cambia y no todas se reconocen con el mismo índice de recuperación. Dependiendo del antígeno O que forma parte de la estructura del LPS y del grado de acilación de la molécula, cambia la hidrofobicidad de la misma, por lo que no se comportan igual en procedimientos de detección que implican diluciones, por ejemplo. También la distribución de cargas en los LPS varía y esto trae aparejados diferentes efectos electrostáticos que inciden en los procesos de reconocimiento. La naturaleza de la endotoxina también puede variar debido a la propia adaptación de una bacteria, en situaciones de estrés, para lograr una mayor protección un mecanismo de defensa de la bacteria puede consistir en cambiar la estructura de los LPS que están conformando su membrana. Todas estas características influyen en la agregación supramolecular de los diferentes LPS, que afectan en gran medida el reconocimiento, pues se presentan en forma de agregados que no producen la activación de la cadena de reacciones que desencadena en la coagulación de la hemolinfa del lisado de amebocitos de Limulus.

Todos los aspectos considerados anteriormente inciden sobre el grado de detección de endotoxinas de un ensayo de LAL, cuando se realizan análisis de una muestra farmacéutica o de otra naturaleza. Los investigadores precisan comprobar que los resultados no son falsos, pues en ocasiones el uso de soluciones de endotoxinas estándares como patrones pueden llevar a errores en las mediciones. No se puede asumir que las endotoxinas enmascaradas, ya sea por formar agregados supramoleculares o por otros factores, no van a causar daño en los organismos vivos. Todas las precauciones que se toman en el diseño de ensayos usando el metodo de LAL, son necesarias para asegurar la fiabilidad de los resultados.

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