Ensayo de LAL recombinante (sintético) frente al ensayo de LAL tradicional
Endotoxinas bacterianas como potentes pirógenos
Las endotoxinas bacterianas están muy extendidas en el medio ambiente. Sin embargo, las endotoxinas también son potentes pirógenos que pueden provocar fiebre, inflamación e incluso un shock séptico si logran entrar al torrente sanguíneo.1
Para prevenir estos graves riesgos, las pruebas de endotoxinas se han implementado de forma rutinaria en el proceso de fabricación de fármacos parenterales y dispositivos médicos. Además, el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) se ha establecido como la norma de referencia para las pruebas de endotoxinas.
El ensayo LAL tradicional
El ensayo LAL tradicional detecta la contaminación por endotoxinas mediante la incubación de proteínas extraídas de la sangre del cangrejo herradura con una muestra contaminada con endotoxinas, lo que inicia la formación de una reacción de coagulación. Puede realizarse como un ensayo cualitativo de coagulación en gel basado en la visualización del coágulo o como un ensayo cuantitativo turbidimétrico o cromogénico, cuyos resultados pueden registrarse con un lector de Toxinometer® o de microplacas, respectivamente.
El ensayo LAL de coágulo de gel se utiliza para la detección cualitativa pero rápida y sensible de endotoxinas mediante la visualización de un coágulo formado. Sin embargo, no permite la cuantificación de endotoxinas.
El ensayo LAL turbidimétrico (KTA) permite cuantificar la endotoxina basándose en la turbidez (enturbiamiento) de la muestra analizada, que se produce tras la escisión enzimática del sustrato pero antes de la formación del gel.
El ensayo LAL cromogénico (KCA) cuantifica la endotoxina detectando y cuantificando fotométricamente la liberación cromogénica causada por la escisión de un sustrato cromogénico.
Riesgos medioambientales asociados con el ensayo LAL tradicional
La producción del reactivo LAL tradicional requiere la captura y el sangrado de cangrejos herradura; sin embargo, el desarrollo de alternativas recombinantes (sintéticas) para las pruebas de endotoxinas reducirá cualquier impacto ambiental que pudiera existir. Esto está en consonancia con el marco de las 3R para la ciencia dependiente de los animales, que refleja el objetivo de reemplazar, reducir y redefinir el uso de animales siempre que sea posible.3
Ensayos de endotoxinas recombinantes (sintéticas) disponibles en la actualidad
Ensayos basados en el factor C recombinante – El factor C es el componente inicial de la cascada de coagulación de los cangrejos herradura. Es inducido por endotoxinas y se ha utilizado para el desarrollo de ensayos de endotoxinas recombinantes. Los ensayos basados en el factor C recombinante no requieren el uso de amebocitos de cangrejo herradura y pueden detectar endotoxinas con alta sensibilidad y especificidad.
Ensayo LAL sintético Pyrostar – FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation ha desarrollado un nuevo reactivo recombinante de detección de endotoxinas 100% libre de componentes animales, PYROSTAR™ Neo. Imita la reacción en cascada de los reactivos de LAL tradicionales con tres factores recombinantes (Factor C, Factor B y enzima proclotante) y ofrece una alta sensibilidad y especificidad. PYROSTAR™ Neo se basa en el grupo cromogénico pNA para cuantificar la endotoxina con un método colorimétrico sensible compatible con un lector de placas de absorbancia. Además, este método eliminó el riesgo de falsos positivos relacionados con (1-->3) ß-D-glucano mediante el uso de reactivos específicos de endotoxina.
Mensaje final
El ensayo LAL puede determinar cualitativa o cuantitativamente la contaminación por endotoxinas con gran sensibilidad y especificidad. Sin embargo, los ensayos LAL tradicionales se basan en el sangrado de cangrejos herradura, lo que podría tener un impacto medioambiental. El desarrollo de ensayos recombinantes para la determinación de endotoxinas, como los ensayos LAL recombinantes, permite la detección de endotoxinas sin comprometer la sensibilidad y especificidad del ensayo, al tiempo que se eliminan los posibles efectos sobre el medioambiente.
Fuentes bibliográficas
- Sampath VP. Bacterial endotoxin-lipopolysaccharide; structure, function and its role in immunity in vertebrates and invertebrates. Agriculture and Natural Resources, 2018; 52 (2): 115-120.
- Maloney T, Phelan R, Simmons N. Saving the horseshoe crab: A synthetic alternative to horseshoe crab blood for endotoxin detection. PLoS Biology, 2018; 16 (10): e2006607.
- Gorman R. Atlantic Horseshoe Crabs and Endotoxin Testing: Perspectives on Alternatives, sustainable Methods, and the 3Rs (Replacement, Reduction, and Refinement). Frontiers in Marine Science, 2020; 7: fmars.2020.582132.
