Endotoxinas: Un insidioso contaminante de los cultivos celulares

Al cultivar cualquier tipo de células en un entorno de laboratorio, una de las principales consideraciones es evitar su contaminación. Los contaminantes biológicos constituyen a menudo el foco de estos esfuerzos, y también pueden ser los más sencillos de detectar y evitar.

Por ejemplo, la mayoría de las contaminaciones bacterianas o fúngicas pueden detectarse visualmente en los medios de cultivo celular y prevenirse mediante tratamientos con antibióticos. Otros contaminantes biológicos, como el micoplasma u otras líneas celulares,  son más difíciles de detectar, pero pueden controlarse mediante kits de ensayo disponibles en el mercado.

A diferencia de la contaminación biológica, la contaminación química recibe relativamente poca atención y es más difícil de detectar y evitar. Entre los contaminantes químicos más insidiosos se encuentran las endotoxinas, un tipo de lipopolisacárido que forma la pared celular externa de las bacterias gramnegativas. A diferencia de las bacterias vivas, las endotoxinas no se pueden observar visualmente en los medios de cultivo celular. Además, las endotoxinas no pueden eliminarse con antibióticos, sino que requieren soluciones especializadas de eliminación de endotoxinas.

La contaminación por endotoxinas puede perturbar en gran medida un experimento in vitro, especialmente los que implican células inmunitarias. Los macrófagos muestran una mayor secreción de IL-6 en respuesta a las endotoxinas, mientras que las células T muestran una mayor proliferación y producción de linfocinas.

Las células no inmunes también pueden estar sujetas a desregulación por endotoxinas. Aunque clásicamente se considera que las endotoxinas actúan a través del receptor CD14, las células que carecen de este receptor también pueden mostrar respuestas intensas a la contaminación por endotoxinas. Por ejemplo, un estudio señala que los miocitos cardíacos experimentan disfunción contráctil al exponerse a las endotoxinas. Otros estudios señalan una alteración de la producción de proteínas en las células CHO y una alteración de la eficiencia clonal en las células epiteliales ureterales.

Además, la sensibilidad de diferentes líneas celulares a la contaminación por endotoxinas es muy variable. Algunas líneas celulares muestran desregulación a menos de 1 ng/mL de endotoxina, mientras que otras requieren concentraciones mucho más altas, de hasta 5000 ng/mL. También se ha teorizado que las líneas celulares cultivadas durante muchos años (como las células HeLa y CHO) pueden haber sido seleccionadas naturalmente para la resistencia a las endotoxinas a lo largo del tiempo. Por ello, es difícil determinar un umbral de seguridad universal para la contaminación por endotoxinas.

Las posibles fuentes de contaminación por endotoxinas incluyen agua, medios de cultivo celular, sueros, cristalería y material de plástico. Las endotoxinas son altamente resistentes tanto al autoclave como a la irradiación, lo que significa que pueden estar presentes incluso en ausencia de bacterias viables. Su alta hidrofobicidad también les confiere una fuerte afinidad por los artículos de plástico.

Cuando se trabaja con células en cultivo, es fundamental adquirir productos con bajo nivel de endotoxinas cuando estén disponibles. Sin embargo, dado que la contaminación por endotoxinas puede surgir después de abrir los reactivos, o ser transferida desde el material de vidrio/plástico, también es importante realizar ensayos de endotoxinas regulares.

La opción más popular de ensayo de endotoxinas es el lisado de amebocitos de Límulus (LAL), que se obtiene de la sangre de los cangrejos de herradura. En presencia de endotoxinas, una enzima del ensayo inicia una cascada de coagulación, que puede utilizarse para cuantificar los niveles de endotoxinas con gran precisión y sensibilidad.

Se recomienda realizar regularmente ensayos de LAL en todos los reactivos de cultivo celular, especialmente antes de cualquier experimento in vitro a gran escala o crucial. La facilidad y el bajo coste que requiere el ensayo LAL lo convierten en una opción ideal para los ensayos frecuentes de endotoxinas.

Fuente: https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/TC-305.pdf