El (1,3)-β-D-glucano y su interferencia en el ensayo de LAL

El (1,3)-β-D-glucano es un polisacárido que se encuentra en una gran variedad de plantas, hongos y bacterias. Este polímero se puede encontrar sustituido en diferentes posiciones de la cadena, y aparece de manera natural en diferentes conformaciones, según la especie, dependiendo de los sustituyentes que tenga la estructura y su posición espacial respecto a los otros grupos de la cadena.

Los β-D-glucanos, tienen diferentes efectos en mamíferos, son mediadores de la respuesta inmune, actúan activando diferentes receptores de la respuesta proinflamatoria. Por lo general no se digieren en el intestino, son sustancias que sirven como fuente de energía a los diferentes microorganismos que habitan en el tracto gastrointestinal a través de la fermentación. Estas moléculas se han utilizado como método de diagnóstico de infecciones por hongos en humanos, como aditivo alimentario por sus propiedades como prebióticos y como inmunomodulares. Se han realizado estudios para su uso como potenciales fármacos por sus efectos anticancerígenos y como reductores del colesterol, entre otros. Algunos de los β-glucanos más estudiados han sido por ejemplo el paramilo, procedente de la Euglena gracilis y el curdlan, proveniente de la Alcaligenes faecalis, para el que se ha propuesto una estructura de triple hélice.

El ensayo LAL se utiliza para la detección de endotoxinas bacterianas, lipopolisacáridos que al igual que los β-D-glucanos, forman parte de la pared celular de bacterias Gram negativas. Para llevar a cabo el ensayo de LAL (Lisado de amebocitos de Limulus) se utiliza la hemolinfa del cangrejo Limulus Polyphemus o cangrejo herradura, de ahí el nombre del ensayo. Los amebocitos contenidos en la hemolinfa de este cangrejo responden con una serie de reacciones en cascada a la presencia de endotoxinas, como mecanismo de defensa contra estas sustancias altamente tóxicas. Las reacciones del sistema inmune provocan la coagulación de las proteínas, que es el fenómeno utilizado como señal analítica en el ensayo de LAL.

En el cangrejo herradura, los β-D-glucanos, al igual que en los mamíferos, también activan receptores del sistema inmune que conducen a la aparición de coágulos, por lo que son una de las principales interferencias en la determinación de las endotoxinas bacterianas. La división LAL de Wako ha solucionado este problema añadiendo curdlan carboximetilado en los reactivos lioflizados que forman parte de los kits que distribuyen para efectuar el ensayo de LAL. Los investigadores de esta compañía descubrieron que cuando el curdlan carboximetilado se encuentra en altas concentraciones, en la disolución donde se realiza la detección de endotoxinas, deja de provocar interferencia en el ensayo, que se convierte en una prueba específica para endotoxinas.

Los kits de Wako se venden a través de la marca PYROSTAR™ y pueden ser adquiridos para fines investigativos en la web. Como se puede constatar en la página web, esta firma comercializa reactivos entre los que se incluyen los kits para la cuantificación de endotoxinas por diferentes métodos de detección, como agua destilada libre de endotoxinas o disolución extractora de endotoxinas y accesorios que complementan los reactivos para el ensayo de LAL. Los accesorios para el ensayo de LAL son tanto los de la serie BioClean® (que tiene tubos, puntas de pipetas, etc) como endotoxina de control estándar o el Toxinometer® ET-6000 del que hablaremos en el próximo artículo.

Bibliografía:

1. John A. Bohn, James N. BeMiller, Carbohydrate Polymers, 28, 1, 3-14, 1995.
2. Chan, G.C., Chan, W.K., and Sze, D.M., Journal of Hematology & Oncology, 2, 1-11, 2009.
3. Tsuchiya, M., Oishi, H., Takaoka, A., Fusamoto, M. and Matsuura, S., Chem Pahrm Bull (Tokyo), 38(9). p. 2523 (1990).

ALGUNOS REACTIVOS LAL