Detección de Endotoxinas mediante el Ensayo de LAL: Método Gel-Clot
El ensayo de lisado de amebocitos de Limulus está recomendado en las farmacopeas internacionales como método de determinación de toxinas bacterianas tanto en las materias primas usadas para la producción de medicamentos como para los productos finales.
Descubra y cotice en línea nuestros Reactivos LAL Específicos para Endotoxinas AQUÍ
Este ensayo también es útil para la industria cosmética y en la elaboración de alimentos, siendo el método aconsejado por la FDA Food and Drug Administration) para la detección de pirógenos.
Ya hace varias décadas que se realiza un esfuerzo por parte de la comunidad científica y de la sociedad en general para minimizar del uso de animales en ensayos de laboratorio. Una de las principales ventajas del ensayo LAL radica en que los cangrejos de los que se extrae la hemolinfa, para de ahí preparar el reactivo LAL, siguen con vida. Este hecho ha contribuido a que el ensayo de LAL sustituya en gran medida el método de detección de pirógenos a través de controles de la fiebre del conejo.
Endotoxinas Bacterianas
Las bacterias Gram negativas tienen su membrana externa formada por lipopolisacáridos, esta estructura es tóxica para otros organismos superiores, como los animales y los hombres. Estos lipopolisacáridos se conocen como endotoxinas, para diferenciarlos de otras toxinas que puedan secretar las bacterias pero que no forman parte de su estructura, llamadas exotoxinas. Cuando las bacterias se multiplican o se destruyen, parte de estas endotoxinas pasan al medio, por lo que ejercen su función patógena.
VEA TAMBIÉN: Variación de endotoxinas/LPS entre especies bacterianas
El mecanismo de toxicidad que desencadenan las endotoxinas es causado por la fracción lipídica de los lipopolisacáridos. Por ejemplo, al ocurrir el lisado de las bacterias dentro de un organismo, la respuesta ante los lípidos que pasan al torrente sanguíneo puede ser a través de la activación del sistema del complemento. Esta fracción lipídica ocasiona la liberación de diferentes citocinas como pueden ser las interleucinas 1 y las 8, probablemente también se activa la producción de factor de necrosis tumoral. La infección que se produce está asociada a procesos inflamatorios, y puede representar un gran peligro para el infestado. Las interleucinas 1 son una serie de citocinas que el organismo libera como respuesta inmune y ante la inflamación. Esta señal hace que se produzca migración de neutrófilos hacia el sitio donde ha ocurrido la infección, generándose la quimiotaxis. Esto facilita que ocurra la fagocitosis, pero en algunos casos dependiendo del estado del sistema inmune del individuo y del grado de infección, las bacterias pueden llegar a provocar una sepsis generalizada, con los riesgos que esto conlleva. Se conocen muchos casos donde las bacterias Gram negativas han causado la muerte por infección sistémica en mamíferos superiores.
Entre las bacterias Gram negativas se encuentran algunas muy conocidas como la Salmonella y la Escherichia coli y otras que no lo son tanto como la Shigella y la Neisseria.
Ensayo de Lisado de Amebocitos de Limulus
El cangrejo Limulus polyphemus es uno de los animales que más años ha sobrevivido en la tierra, sus orígenes datan de hace más de 200 millones de año. Este animal tan resistente experimenta coagulación en su hemolinfa por causa de la presencia de endotoxinas bacterianas. Al descubrirse este hecho en la década de los 60, se continuaron las investigaciones hasta lograr aprovechar esta reacción para realizar ensayos in vitro de detección de endotoxinas en diferentes medios. El Limulus polyphemus pertenece al grupo de los cangrejos herradura, también se le conoce como cangrejo bayoneta o cangrejo cacerola. Este cangrejo habita en la costa atlántica de la parte norte del continente americano, incluyendo el golfo de México.
Los responsables de la coagulación de la hemolinfa de los cangrejos Limulus polyphemus son los amebocitos, principales componentes de la hemolinfa de este animal. Los amebocitos cumplen en los invertebrados la función de los glóbulos blancos en los vertebrados, defienden al organismo de patógenos, por ello ante las endotoxinas provenientes de las bacterias responden liberando una serie de enzimas. Los científicos estudiaron este fenómeno hasta comprobar que si se diluye un lisado de los amebocitos extraídos del cangrejo herradura en un medio acuoso, pueden servir para detectar cantidades muy pequeñas de endotoxinas.
Los amebocitos contienen enzimas procoagulantes que desencadenan una cascada de reacciones. El producto final de estas reacciones en cadena es un gel compuesto por proteínas coaguladas. La respuesta enzimática se produce al entrar en contacto los amebocitos con las endotoxinas. Este mecanismo se compara en muchas ocasiones con el de la tripsina que también desencadena una cascada de reacciones para formar finalmente la trombina, responsable de la coagulación de la sangre en los humanos.
El ensayo LAL solo es válido para detectar endotoxinas y no cualquier otro tipo de pirógeno (nombre que se le da a cualquier compuesto que pueda provocar fiebre). En muchas ocasiones se utiliza este ensayo con el objetivo de detectar otros pirógenos, lo cual es un error. Si bien las endotoxinas bacterianas son de los pirógenos que más prevalecen después de las medidas de sanitización comunes en las industrias, por ser muy resistentes al calor y a los diferentes reactivos químicos usados para esterilización, un ensayo LAL negativo solo indica la ausencia de endotoxinas, no la de otros microorganismos pirógenos. La realización de este ensayo solo conduce a la confirmación de medio libre de pirógenos cuando está acompañado de otros análisis y medidas sanitarias específicas para erradicar el resto de microorganismos contaminantes.
Para el uso del ensayo de LAL se debe realizar una validación para el proceso industrial específico en el que se va a aplicar. La FDA regula las validaciones de este ensayo, encontrándose muchos registros en la literatura de este procedimiento, sobre todo para fármacos inyectables.
Método de Gel-Clot para Cuantificar Endotoxinas mediante el Ensayo de LAL
El ensayo de LAL puede realizarse usando diferentes métodos para medir el proceso de gelificación que ocurre como respuesta de los amebocitos a las endotoxinas. Estos métodos son los llamados Gel-Clot, turbidimetría y métodos cromogénicos. Aquí nos centraremos en el método Gel-Clot o gelificación.
El método Gel-Clot consiste en determinar si aparece un gel, la gelificación ocurre al coagularse las proteínas por la presencia de endotoxinas. El límite de detección de los ensayos depende del fabricante del kit que contiene el reactivo de LAL, normalmente usando el método de Gel-Clot el límite de detección está entre 0.01 y 0.03 unidades de endotoxinas por mililitro de disolución usada en el ensayo. Esto significa que por debajo de esta concentración de endotoxinas no se llega a formar un gel sólido, que permanezca en el tubo de ensayo al mover el mismo. Un criterio usado en el método de gelificación es girar el tubo de ensayo hasta cubrir un ángulo de 180º con el giro y comprobar que el gel se mantiene intacto. El método Gel-Clot puede usarse de manera cualitativa, dando resultados positivo o negativo si no se llega a formar el gel, y semicuantitativa.
La división LAL de Wako comercializa un test de LAL que funciona mediante el método de Gel-Clot, el Test Limulus ES-II de Wako. Con el uso de este test se elimina la interferencia del β-1,3-glucano, otro polisacárido que se encuentra en la pared celular de bacterias y hongos, que en pequeñas cantidades puede interferir la medición de endotoxinas. Este test contiene ya el β-1,3-glucano en una mayor concentración que la que suele haber en los medios donde se realiza el análisis de endotoxinas, este compuesto en altas concentraciones no desencadena las reacciones que conducen a la formación de la coagulina. El uso de este test está restringido para investigación, el procedimiento es sencillo pero debe realizarse con mucha precaución para evitar contaminación de las muestras. Después de incubar los tubos donde se realiza el ensayo a 37 grados durante una hora, se giran los mismos boca abajo para comprobar si se formó o no el gel. Siendo este un ensayo cualitativo.
Además del Test Limulus ES-II, Wako provee a los investigadores de una línea especializada en accesorios y reactivos para LAL. Entre los productos ofertados se encuentra endotoxina estándar de control, disolución para la extracción de endotoxinas y un toxinómetro. Así como otros test diseñados para la determinación de endotoxinas por métodos cromogénicos.
