Detección de endotoxinas específica y confiable utilizando los reactivos de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) PYROSTAR™ ES-F

Incluso pequeñas cantidades de endotoxina causan inflamación, fiebre y daño tisular, cuando se inyectan o implantan en humanos, y pueden provocar sepsis e incluso la muerte. Las endotoxinas son un componente integral de la membrana externa de las bacterias gramnegativas y, por lo tanto, son omnipresentes en el medio ambiente. Para prevenir los posibles efectos negativos graves de la administración de endotoxinas parenterales, se ha introducido la prueba de endotoxinas como paso crítico en el desarrollo y control de calidad de productos biofarmacéuticos y dispositivos médicos. El ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) es el método más ampliamente establecido para la detección de endotoxinas. Su utilidad ha sido probada tanto en numerosos estudios como en la práctica. Sin embargo, el ensayo LAL también se asocia con problemas, entre ellos el riesgo de resultados falsos positivos y falsos negativos.¹ Estas limitaciones de la prueba LAL tienen importantes implicaciones prácticas, porque es muy probable que los resultados de las pruebas tanto falsos positivos como falsos negativos conduzcan a una mala interpretación de los hallazgos e interfieran con la atención adecuada al paciente.

El desarrollo de los reactivos PYROSTAR™ ES-F LAL de Wako para la detección de endotoxinas representa un avance importante con respecto a la detección confiable y específica de endotoxinas bacterianas al reducir las tasas de resultados de pruebas LAL falsos positivos y falsos negativos. Los reactivos PYROSTAR™ ES-F LAL se pueden utilizar para la detección de endotoxinas tanto cualitativa como cuantitativa mediante un método de coágulo de gel o un método turbidimétrico cinético, respectivamente.

Reducción del índice de falsos positivos en las pruebas LAL mediante la inclusión de curdlan carboximetilado (CMC) en el tampón ES-F

Los resultados falsos positivos obtenidos en el ensayo  LAL pueden deberse a la contaminación con productos fúngicos y celulósicos que contienen (1,3) -beta-D-glucano.^1,3 En particular, el (1,3) -beta-D-glucano y las endotoxinas inducen la formación de coágulos en el ensayo LAL a través de dos vías distintas. El (1,3) -beta-D-glucano estimula la formación de coágulos mediante la activación del factor G, lo que da lugar a un resultado falso positivo. Sin embargo, las endotoxinas estimulan la formación de coágulos a través de la activación del factor C, que a su vez activa el factor de coagulación B. En particular, el (1,3) -beta-D-glucano es inofensivo en las concentraciones bajas que causan resultados falsos positivos en el ensayo LAL, aunque puede tener efectos nocivos en concentraciones elevadas.

El tampón ES-F reduce la tasa de resultados falsos positivos en el ensayo LAL mediante la adición de una alta concentración de curdlan carboximetilado (CMC). La CMC está estrechamente relacionada con el (1,3) -beta-D-glucano e interactúa con el factor G pero no lo activa. Esta interacción, a su vez, evita la activación del factor G por el (1,3) -beta-D-glucano. Inicialmente, Wako PYROSTAR™ desarrolló el tampón ES que contiene CMC, el cual hace que el reactivo LAL sea específico para las endotoxinas cuando se usa para su reconstitución. Posteriormente, se introdujo la formulación de tampón Wako PYROSTAR™ ES-F, que contiene CMC y LAL co-liofilizados, lo que optimiza aún más la conveniencia y facilidad de uso de los reactivos. 

Reducción del índice de resultados falsos negativos y falsos positivos en el ensayo LAL gracias a las propiedades amortiguadoras de ES-F

En particular, el tampón PYROSTAR™ ES-F también disminuye la tasa de resultados falsos positivos y falsos negativos inducidos por las desviaciones del pH gracias a sus propiedades amortiguadoras. Los reactivos LAL funcionan correctamente solo en un ambiente neutro, porque un ambiente ácido o básico puede causar resultados tanto falsos negativos como falsos positivos. Tanto los ácidos como las bases pueden desnaturalizar e inactivar los factores implicados en el ensayo LAL, lo que da lugar a resultados falsos negativos. Sin embargo, incluso un ambiente levemente ácido (pH 6) o básico (pH 8) también se ha asociado con un mayor índice de falsos positivos en comparación con un ambiente neutro (pH 7).⁴ El tampón ES-F contiene Tris como componente tampón, el cual neutraliza tanto los ácidos como las bases, lo que mantiene de manera flexible el rango de pH óptimo de la mezcla de reactivos y disminuye el índice de resultados falsos negativos y falsos positivos en el ensayo LAL.

Los reactivos PYROSTAR™ ES-F LAL como método altamente confiable y específico para la prueba LAL

Las pruebas de endotoxinas confiables y específicas son clave para garantizar la seguridad de los productos biofarmacéuticos y los dispositivos médicos. El desarrollo del tampón ES-F como componente de los reactivos PYROSTAR™ ES-F LAL reduce en gran medida los índices de resultados falsos positivos y falsos negativos en el ensayo LAL, y por lo tanto crea un reactivo LAL increíblemente específico y promueve la seguridad del paciente.

Bibliografía

1. Nalepka JL, Greenfield EM. Detection of bacterial endotoxin in human tissues. Biotechniques. 2004;37(3):413–417. https://doi.org/10.2144/04373ST06
2. Jackson BR. The dangers of false-positive and false-negative test results: false-positive results as a function of pretest probability. Clin Lab Med. 2008;28(2):305–319. doi: 10.1016/j.cll.2007.12.009.
3. Anderson J, Eller M, Finkelman M, Birx D, Schlesinger-Frankel S, Marovich M. False positive endotoxin results in a DC product caused by (1-->3)-beta-D-glucans acquired from a sterilizing cellulose filter. Cytotherapy. 2002;4(6):557–559. doi: 10.1080/146532402761624728.
4. Lourenço FR, Botelho Tde S, Pinto Tde J. How pH, temperature, and time of incubation affect false-positive responses and uncertainty of the LAL gel-clot test. PDA J Pharm Sci Technol. 2012;66(6):542–546. doi: 10.5731/pdajpst.2012.00887.