Contaminación por Endotoxinas y sus Consecuencias en los Nuevos Tratamientos de CRISPR/Cas9
¿Qué es CRISPR/Cas9?
CRISPR/Cas9 genome editing technique, uses Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) and CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9).
Esta tecnología permite editar el genoma de forma eficaz y rentable, facilitando la manipulación de genes en células y organismos. Los laboratorios la utilizan para diversos fines, como la generación rápida de modelos celulares y animales, la realización de detecciones genómicas funcionales y la obtención de imágenes del genoma celular en tiempo real.
Se ha demostrado que esta técnica puede fijar con éxito ADN defectuoso en ratones, tratando eficazmente sus trastornos genéticos, y también puede manipular embriones humanos. Las aplicaciones clínicas actuales investigan el desarrollo de métodos de tratamiento para VIH, fibrosis quística, hemofilia y cáncer.[1]
Contaminación por endotoxinas en CRISPR/Cas9
Las bacterias E. coli se utilizan habitualmente para expresar proteínas Cas9 terapéuticas debido a su costo-eficiencia y alto rendimiento de producción. A pesar de ello, estas bacterias gramnegativas también generan lipopolisacáridos (LPS) que se consideran subproductos indeseables de las endotoxinas. Estas endotoxinas pueden causar una inflamación grave al inducir una respuesta inmunitaria humana.[2, 3].
Por lo tanto, es importante prestar especial atención a la producción de la proteína Cas9. Esto nos permite desarrollar usos potenciales de Cas9 como proteína terapéutica en el tratamiento clínico.
Efectos de la contaminación por endotoxinas
La seguridad y eficacia de la terapia pueden verse afectadas por las respuestas inmunológicas a las proteínas utilizadas en los tratamientos médicos, que también pueden provocar efectos adversos graves en los pacientes, a veces incluso potencialmente mortales.
En las evaluaciones del riesgo de inmunogenicidad, las proteínas derivadas de microbios se clasifican como de alto riesgo. Las proteínas recombinantes producidas por E. coli suelen contener endotoxinas debido a la elevada presencia de lipopolisacáridos (LPS) en la pared celular bacteriana. [3]
Han surgido preocupaciones debido a los informes sobre las reacciones inmunológicas a las proteínas Cas9, lo que sugiere que la inmunogenicidad podría plantear obstáculos a la aplicación clínica de la edición del genoma CRISPR.
Pruebas de endotoxinas con el método LAL
La prueba LAL, que utiliza el extracto acuoso de células sanguíneas de Limulus polyphemus, se emplea ampliamente para la identificación in vitro de endotoxinas bacterianas. Está ampliamente considerado como el método más confiable y sensible. Desde su aprobación por la FDA en la década de 1970, el ensayo de LAL en gel coagulado se ha adoptado ampliamente como método oficial para la detección de endotoxinas bacterianas.[4]
El ensayo LAL es muy sensible y capaz de detectar niveles de endotoxinas de entre 0,01 y 10 EU/dispositivo en productos farmacéuticos o dispositivos médicos, lo que garantiza el cumplimiento de las directivas de la FDA. [5]
Es importante detectar el nivel de endotoxinas en la proteína Cas9 para garantizar la aplicación eficaz de la técnica de edición del genoma CRISPR/Cas9.
Referencias
- Redman M, King A, Watson C, King D: What is CRISPR/Cas9?Archives of disease in childhood Education and practice edition 2016, 101(4):213-215.
- Singpant P, Tubsuwan A, Sakdee S, Ketterman AJ, Jearawiriyapaisarn N, Kurita R, Nakamura Y, Songdej D, Tangprasittipap A, Bhukhai K et al: Recombinant Cas9 protein production in an endotoxin-free system and evaluation with editing the BCL11A gene in human cells. Protein Expression and Purification 2023, 210:106313.
- Simhadri V, McGill J, Sauna Z: Endotoxin contamination in commercially available Cas9 proteins potentially induces T-cell mediated responses. Gene Therapy 2021, 30:1-6.
- Tamura H, Reich J, Nagaoka I: Outstanding Contributions of LAL Technology to Pharmaceutical and Medical Science: Review of Methods, Progress, Challenges, and Future Perspectives in Early Detection and Management of Bacterial Infections and Invasive Fungal Diseases. Biomedicines 2021, 9(5).
- Sandle T: FDA guidance on pyrogens and endotoxin testing.
