Cómo seleccionar el método de prueba y la sensibilidad correctos para la detección de endotoxinas
Riesgos asociados con la exposición a endotoxinas
Las endotoxinas son pirógenos y representan un componente clave de la membrana externa de las bacterias gramnegativas. Si se administran por vía parenteral, los productos contaminados con endotoxinas pueden tener consecuencias graves, como inflamación, hemorragia, shock séptico e incluso la muerte.1 Las endotoxinas están presentes de forma ubicua en el medio ambiente, y los productos farmacéuticos inyectables y los dispositivos médicos, así como las materias primas a partir de las cuales se producen, deben someterse a pruebas de contaminación por endotoxinas. Se han desarrollado varios grupos de métodos para la prueba de endotoxinas para abordar esta necesidad.2
Pruebas para la detección de endotoxinas o pirógenos
Prueba de pirógenos en conejo
La prueba de pirógenos en conejos fue históricamente uno de los primeros métodos desarrollados para detectar pirógenos.2 Se trata de una prueba in vivo basada en el hecho de que la administración parenteral de pirógenos induce aumento de temperatura/fiebre en conejos. Sin embargo, la prueba de pirógenos en conejos no es específica para las endotoxinas, porque no solo las endotoxinas sino todos los pirógenos provocan un aumento de la temperatura. Además, la prueba de pirógenos en conejos prácticamente nunca es la elección correcta para una nueva aplicación de prueba.
Ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL)
El ensayo LAL in vitro es la prueba de endotoxinas más utilizada que ha reemplazado en gran medida la prueba de pirógenos en conejos.2 El ensayo LAL es sensible y específico. Utiliza el reactivo LAL aislado de amebocitos del cangrejo herradura del Atlántico (Limulus polyphemus), que forma un coágulo al incubarse con una endotoxina. El ensayo LAL se puede realizar como prueba de coágulo de gel, cromogénica o turbidimétrica.
Técnica de coágulo de gel LAL
La técnica cualitativa de coágulo de gel LAL es la prueba LAL estándar. Se basa en la interacción de enzimas pro-coagulación en el LAL con endotoxinas, lo que activa una cascada de coagulación, que modifica el coagulógeno de amebocitos y forma un coágulo de gel. Luego se detecta visualmente la formación de coágulos. La técnica del coágulo de gel es sensible y fácil de usar, pero puede llevar mucho tiempo si es necesario evaluar un gran número de muestras. Sin embargo, la técnica del coágulo de gel suele ser la opción más adecuada para los nuevos programas de prueba que requieren una prueba fácil y versátil que proporcione resultados constantes.
Ensayo LAL turbidimétrico
El ensayo LAL turbidimétrico cuantitativo se basa en la formación de turbidez después de la escisión del sustrato enzimático y antes de la formación de un gel. Los niveles más altos de endotoxinas conducen a un aumento más rápido de la turbidez, que se puede cuantificar mediante un espectrofotómetro o un lector de microplacas. El ensayo LAL turbidimétrico también es sensible y fiable, pero permite la cuantificación de datos y el análisis de alto rendimiento. Además, con frecuencia esta es la prueba elegida por los nuevos usuarios y los usuarios de la técnica del coágulo de gel que se están expandiendo a mayores volúmenes de prueba y necesitan resultados cuantitativos de endotoxinas.
Ensayo LAL cromogénico
El ensayo LAL cromogénico representa una modificación de la reacción del coágulo de gel. Se basa en la escisión de un sustrato cromogénico, la liberación de cromógeno y la visualización de la reacción colorimétrica. El ensayo LAL cromogénico permite realizar mediciones de LAL altamente sensibles, cuantitativas y automatizadas y también se puede ampliar para análisis de alto rendimiento. A menudo es la elección correcta para los usuarios que requieren pruebas más allá de los límites del ensayo LAL turbidimétrico. Esto puede deberse a que el color de la muestra no es adecuado para la transmisión transparente requerida para el ensayo LAL turbidimétrico, o porque las muestras requieren pruebas con una sensibilidad extremadamente alta.
Otros métodos para la detección de endotoxinas y pirógenos
Prueba de activación de monocitos
La prueba de activación de monocitos (MAT) se desarrolló como una prueba de pirógenos in vitro.2 Se basa en el aislamiento de monocitos de sangre humana periférica y su incubación con una muestra analizada para determinar el contenido de pirógenos. Si la muestra está contaminada con pirógenos, estimula a los monocitos para que liberen citocinas inflamatorias, que pueden cuantificarse mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). La prueba de activación de monocitos es un ensayo in vitro fiable para la detección de pirógenos. Sin embargo, detecta todos los pirógenos y no solo las endotoxinas. Sin embargo, la prueba de activación de monocitos es frecuentemente la prueba de elección para la prueba cuantitativa de todos los pirógenos sin necesidad de animales vivos.
Ensayos basados en el factor C recombinante
El factor C recombinante también se ha utilizado para el desarrollo de ensayos de endotoxinas. El factor C es el componente inicial de la cascada de coagulación del cangrejo herradura, que es inducida por endotoxinas. Los ensayos basados en el factor C recombinante se basan en el principio de la prueba LAL, pero evitan el uso de amebocitos de cangrejo herradura mediante el empleo del factor C recombinante.2 A menudo, representan la opción de prueba más adecuada para usuarios nuevos o usuarios del ensayo LAL turbidimétrico que están ansiosos por emplear un ensayo LAL innovador y completamente sintético que no contenga productos de cangrejo herradura pero que conserve las ventajas del ensayo LAL tradicional.
Desarrollo de biosensores para la detección de endotoxinas
Los biosensores, basados en componentes de la afinidad de la endotoxina, se están desarrollando como métodos de detección de endotoxinas independientes de la reacción enzimática Lal. Sin embargo, la estandarización y la amplia aplicación de estos enfoques novedosos aún enfrentan desafíos importantes.3
Consideraciones para la selección de pruebas de endotoxinas
El ensayo LAL ha reemplazado en gran medida la prueba de pirógenos en conejos como prueba estándar para la detección de endotoxinas. Es confiable y sensible y se puede realizar como un ensayo de coágulo de gel, turbidimétrico o cromogénico. Sin embargo, la selección de la prueba más adecuada para la detección de endotoxinas depende de una serie de factores, entre ellos el equipo disponible, el número y las características de las muestras que deben evaluarse y, en determinados casos, los requisitos reglamentarios aplicables.2
Literature sources:
- Farhana A, Khan YS. Biochemistry, Lipopolysaccharide. [Updated 2021 Apr 29]. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2022 Jan-. Disponible de: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK554414/.
- Suvarna, K. Endotoxin detection methods – Where are we now?American Pharmaceutical Review. 2015, August 25.
- Su W, Ding X. Methods of endotoxin detection.Journal of Laboratory Automation. 2015 Aug;20(4):354–364.
