Como mantener su entorno de pruebas libre de endotoxinas con un presupuesto limitado

Cuando las endotoxinas bacterianas, que son pirógenos, acceden al torrente sanguíneo, provocan fiebre e incluso pueden provocar sepsis y shock séptico.¹ En un entorno de investigación, la contaminación por endotoxinas también tiene consecuencias negativas, ya que puede conducir a resultados científicos erróneos y engañosos. Las endotoxinas bacterianas se encuentran en la membrana externa de las bacterias gramnegativas y se liberan principalmente durante la lisis bacteriana. Según se informa, una sola célula de E. coli puede abarcar hasta 2 millones de moléculas de LPS (endotoxina).²

Debido a los graves riesgos asociados con la contaminación por endotoxinas, las pruebas de endotoxinas se han establecido como un componente clave del proceso de fabricación de productos parenterales. El ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) es la prueba de endotoxinas mejor establecida que ha logrado una amplia aceptación. Se basa en la incubación de un extracto de amebocitos del cangrejo herradura con una muestra analizada para determinar el contenido de endotoxinas. Si la muestra contiene endotoxina, se desarrolla la coagulación de la sangre y se forma un coágulo que puede evaluarse visualmente en un ensayo de coágulo de gel.³ La técnica del coágulo de gel es fácil de usar, no requiere equipo costoso y la interpretación de sus resultados es directo. Por lo tanto, es adecuado para su uso como ensayo cualitativo, cuando el presupuesto para la prueba es limitado. Para aplicaciones que requieren datos exactos de endotoxinas cuantitativas y cinéticas, se pueden utilizar versiones turbidimétricas o cromogénicas del ensayo LAL.

La contaminación por endotoxinas del entorno de pruebas puede ocurrir a través de varias rutas, entre ellas el agua, la piel, el aire, el material de plástico o vidrio contaminados y soluciones y reactivos de laboratorio.⁴ Mantener su entorno de pruebas libre de endotoxinas es un requisito clave para garantizar resultados de prueba confiables.

Desarrollar una estrategia integral para las pruebas de LAL y para el mantenimiento de un entorno de pruebas libre de endotoxinas: esto es importante porque la prevención de la contaminación por endotoxinas es mucho más rentable que el complicado proceso de descontaminación de endotoxinas. La estrategia debe especificar el tipo de prueba de endotoxinas, la frecuencia de las pruebas y otras medidas planificadas para mantener el medio ambiente libre de endotoxinas.

Asegurar el acceso a agua libre de endotoxinas: el agua, que se puede usar como solvente, para el lavado de muestras o para la limpieza de instrumentos, es una de las fuentes más importantes de contaminación por endotoxinas que puede ocurrir debido a una purificación insuficiente del agua o un almacenamiento en condiciones inadecuadas.⁵ Para garantizar que el agua no se contamine, se pueden utilizar sistemas de ultrapurificación basados en destilación en vidrio u ósmosis inversa. Además, se debe evitar el almacenamiento prolongado de agua de alta pureza y solo se deben usar recipientes no pirogénicos para el almacenamiento. Si no se dispone de un sistema de ultrapurificación de agua, se puede utilizar agua no pirógena para inyección.

Emplear una técnica aséptica para la manipulación de muestras: la piel humana también puede ser una fuente de contaminación por endotoxinas. Por lo tanto, se debe emplear una técnica aséptica al realizar pruebas de endotoxinas y manipular muestras.

El uso de artículos de plástico y vidrio libres de pirógenos: las endotoxinas tienen una alta afinidad para los artículos de plástico y hardware y se les adhieren fuertemente. Además, ni el lavado regular ni el autoclave pueden eliminar las endotoxinas de forma fiable. Sin embargo, los artículos de plástico libres de pirógenos están ampliamente disponibles comercialmente y su uso disminuye el riesgo de contaminación por endotoxinas. Además, la endotoxina se puede eliminar de forma fiable del material de vidrio mediante despirogenación con calor seco a 180 °C durante 4 h/noche o a 250 °C durante 30 min.

Selección de medios y aditivos probados con endotoxinas: los medios, reactivos y aditivos probados con endotoxinas deben usarse como precaución contra la contaminación por endotoxinas. Las pruebas pueden ser realizadas tanto por el fabricante como internamente.

Referencias

1. Sampath VP. Bacterial endotoxin-lipopolysaccharide; structure, function and its role in immunity in vertebrates and invertebrates. Agriculture and Natural Resources, 2018; 52 (2): 115-120. https://doi.org/10.1016/j.anres.2018.08.002.
2. Rhee SH. Lipopolysaccharide: basic biochemistry, intracellular signaling, and physiological impacts in the gut. Intest Res. 2014;12(2):90-5. doi: 10.5217/ir.2014.12.2.90.
3. FDA. Guidance for industry: pyrogen and endotoxins testing: questions and answers. June 2012.
4. Gorbet MB, Sefton MV. Endotoxin: The uninvited guest. Biomaterials. 2005;26(34):6811–6817. doi: 10.1016/j.biomaterials.2005.04.063.
5. FDA. Bacterial Endotoxins/Pyrogens. Content current as of: 11/17/2014. https://www.fda.gov/inspections-compliance-enforcement-and-criminal-investigations/inspection-technical-guides/bacterial-endotoxinspyrogens