¿Cómo funciona el ensayo LAL?

Las bacterias gramnegativas pueden causar diferentes enfermedades, incluidos varios tipos de intoxicación alimentaria, neumonía y enfermedades de transmisión sexual. Estas bacterias contienen moléculas llamadas endotoxinas en sus paredes celulares. Incluso sin bacterias vivas, las endotoxinas residuales pueden ser mortales al contaminar productos farmacéuticos o dispositivos médicos. El contacto con las endotoxinas puede desencadenar fiebre o incluso sepsis.

Para evitar la contaminación por endotoxinas, las empresas usan el ensayo del lisado de Amebocito Límulus (LAL). El ensayo LAL es una forma simple, económica y robusta de detectar incluso niveles bajos. El ingrediente activo del ensayo proviene del cangrejo herradura (Limulidae). La hemolinfa (un fluido similar a la sangre) del cangrejo contiene células inmunes llamadas amebocitos.

Estos amebocitos son la clave del ensayo LAL. Tras la exposición a las endotoxinas, los amebocitos experimentan una reacción química rápida que hace que las células se peguen unas a otras y formen un coágulo. El cangrejo herradura usa este mecanismo para protegerse contra el patógeno y evitar que se propague al resto del animal.  Sin embargo, podemos sacar partido de este proceso para detectar endotoxinas en productos médicos.

¿Cómo funciona la cascada de coagulación? Se debe principalmente a tres zimógenos de serina proteasa: factor C, factor B y una encima coaguladora. Los zimógenos (también conocidos como proenzimas) son enzimas inactivas en ausencia de estímulos, en este caso las endotoxinas. Deben escindirse para activarse.

Tras la exposición a las endotoxinas, el factor C se escinde y, por lo tanto, se activa. El factor C activado escinde y activa el factor B, el cual escinde y activa la encima coaguladora. Finalmente, esta enzima activa coaguladora escinde otra proteína llamada coagulógeno. Una gran cantidad de moléculas de coagulógeno escindidas se combinan para formar un coágulo. La reacción es muy eficiente, por lo que el coágulo se forma en solo 90 segundos.

El ensayo LAL se aprovecha de esta cascada química. En su formato original, el ensayo era cualitativo: los investigadores simplemente buscaban la formación de gel para determinar la contaminación por endotoxinas. Sin embargo, las variaciones modernas del ensayo han aumentado considerablemente su fiabilidad y sensibilidad.

Una versión cuantitativa del ensayo LAL usa una lectura cromogénica que depende de una sustancia llamada Boc-Leu-Gly-Arg-p-nitroanilida. La secuencia de aminoácidos de la molécula coincide con la del lugar escindido en el coagulógeno por la enzima de coagulación. Como resultado, al activar la encima de coagulación, esta escinde la sustancia Boc-Leu-Gly-Arg y libera p-nitroanilida cromogénica. La absorbancia de p-nitroanilida libre se puede detectar a 405 nm.

Otra variante de LAL usa una lectura turbidimétrica. La turbidez indica la pérdida de transparencia en una solución acuosa en función de la presencia de sólidos en suspensión. Cuanto más turbio esté el líquido, más sólidos habrá. En el caso del ensayo de LAL, los sólidos son coágulos de gel formados durante la reacción de coagulación. Al medirlos con un instrumento como Toxinometer® ET-7000 de Wako, se puede cuantificar de forma precisa la cantidad de coagulación y utilizar la información para calcular el contenido de endotoxinas.

Tal y como se ha descrito, la cascada de coagulación de las endotoxinas es una respuesta inmune muy efectiva que ha evolucionado a lo largo de millones de años. Gracias a las tecnologías modernas, podemos aprovechar esta reacción para crear una detección de endotoxinas en productos médicos que puede salvar vidas.

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