¿Cómo evitar la interferencia de nanopartículas en el ensayo LAL?

Ciertos avances tecnológicos recientes han permitido el uso de nanomateriales en la biología y la medicina. Las nanopartículas tienen propiedades fisioquímicas que ofrecen nuevas estrategias para tratar las enfermedades. Sin embargo, estos nanomateriales tienen el potencial de provocar respuestas inmunitarias peligrosas, a causa de la presencia de endotoxinas bacterianas.

Las endotoxinas son lipopolisacáridos grandes y termoestables que se encuentran en la membrana de las bacterias gramnegativas. Cuando el sistema inmunitario innato queda expuesto a las endotoxinas, puede producir un choque séptico que es potencialmente mortal. Por esta razón, la FDA requiere que todos los medicamentos y dispositivos médicos tengan niveles de endotoxinas bajo este umbral regulado.

Según un informe,la mayoría de nanomateriales disponibles a nivel comercial están contaminados por endotoxinas. Esto presenta un desafío para el nuevo campo de la nanotoxicología, que debe diferenciar la toxicidad intrínseca de un nanomaterial, de la toxicidad producida por la contaminación.

El ensayo de LAL (Lisado de Amebocito Límulus) es el método más popular de detección y cuantificación de las endotoxinas. Depende de los glóbulos sanguíneos (amebocitos) del cangrejo herradura. Tras el contacto con las endotoxinas, una cascada química induce la coagulación como mecanismo de defensa contra la infección. El ensayo LAL utiliza esta reacción de coagulación para cuantificar los niveles de endotoxinas.

Sin embargo, varios estudios han demostrado que las nanopartículas pueden interferir con la prueba LAL, lo cual produce una estimación por exceso o insuficiente de los niveles de endotoxinas. En algunos casos, las nanopartículas pueden interactuar con enzimas en las reacciones de coagulación. Tambiés es posible que la densidad óptica de las nanopartículas interfiera con las lecturas aguas abajo del LAL, en particular con el método cromogénico.

Para evitar estos problemas, es importante considerar detenidamente qué método LAL es el más fiable en función de las propiedades intrínsecas del nanomaterial. Uno de los métodos LAL más comunes (gel-clot, turbidimétrico y cromogénico), el método cromogénico, generalmente se considera el más resistente a las interferencias por nanopartículas. Este método usa un sustrato de color que se forma mediante la reacción de coagulación de las endotoxinas.

Sin embargo, las nanopartículas con una gran densidad óptica pueden interferir también con el método cromogénico. Un método alternativo en estos casos es el método turbidimétrico, que mide la turbidez de la solución LAL. Con este método deben evitarse nanopartículas con gran concentración, ya que aumentan la turbidez de la solución y alteran los resultados del ensayo.

Tras seleccionar el mejor método, deben utilizarse controles apropiados para normalizar los resultados. Para minimizar las interferencias, las nanopartículas deben diluirse antes de realizar la cuantificación de endotoxinas. La dilución válida máxima depende de la sensibilidad del reactivo LAL usado.

La serie Limulus Color KY de FUJUFILM Wako es una opción robusta para la detección de endotoxinas en muestras con nanopartículas. Este kit en particular, que utiliza un método cromogénico, es más resistente a la interferencia por nanopartículas.

Además, el kit es muy sensible, con un límite de detección cuantitativo de 0,0002 EU/ml (tipo único) o 0,0005 EU/ml (tipo múltiple). Esto permite una alta dilución válida máxima, lo que minimiza aún más el riesgo de interferencias.

Para nanopartículas con una alta densidad óptica, puede usarse la serie PYROSTAR™ ES-F. Estos kits dependen de una lectura turbidimétrica y tienen un rango de detección muy bajo de 0,001 EU/ml.

KIT DE REACTIVOS LAL:

Solución extractora de endotoxina	Kit de 4 PYROSTAR™ ES-F (5.2 ML) con CSE	PYROSTAR ES-F Plate con CSE