Análisis de los pros y los contras de diferentes métodos y equipos para ensayos de LAL

La introducción de endotoxinas bacterianas en el sistema circulatorio humano puede inducir una respuesta pirogénica potente, que da lugar a fiebre, inflamación y, potencialmente, shock séptico. La membrana externa de las bacterias Gram negativas alberga endotoxinas, que prevalecen en el medio ambiente. Por consiguiente, es obligatorio realizar pruebas rutinarias de endotoxinas en los productos farmacéuticos y dispositivos médicos parenterales. Globalmente aceptado e incluido en la Farmacopea Internacional, el ensayo LAL es la prueba definitiva para la detección de endotoxinas, aprobada por las autoridades regulatorias de todo el mundo.[1]
El lisado de amebocitos de Limulus (LAL), un sistema de detección muy sensible para componentes bacterianos y fúngicos de la pared celular, está presente en las células sanguíneas del cangrejo herradura. Los ensayos de LAL han contribuido significativamente al progreso en el control de calidad de productos farmacéuticos y médicos, sustituyendo con eficacia a la prueba de pirógenos en conejos.[2]

Diferentes categorías de ensayos LAL

Coágulo de gel

La prueba del coágulo de gel del lisado de amebocitos de Limulus (LAL) recibió la aprobación de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) en la década de 1970 y desde entonces se ha adoptado ampliamente como técnica autorizada para detectar endotoxinas bacterianas. La prueba LAL se basa en la respuesta de coagulación de un complejo enzimático derivado de células de cangrejo herradura, con endotoxinas bacterianas.[3]

Turbidimétrico
Tras la adición del reactivo para el sustrato del ensayo
LAL, cada muestra se mezcla exhaustivamente y se incuba en un lector turbidimétrico a 37 °C. Los dispositivos espectrofotométricos, como el Toxinometer® y los lectores de microplacas, facilitan la monitorización automatizada durante todo el periodo de incubación posterior. Existe una correlación negativa entre el tiempo de reacción medido (desarrollo de turbidez) y la concentración de endotoxinas en la muestra.[4]

Cromogénicos
Los métodos cromogénicos se utilizan para cuantificar la respuesta colorimétrica resultante de la hidrólisis enzimática de un sustrato cromogénico[4]. Se ha desarrollado un nuevo método para crear un reactivo en cascada recombinante (rCR) sintetizando y formulando las proteínas de la cascada LAL

Reactivos para pruebas LAL

PYROSTAR™ Serie ES-F

Pros
Los reactivos PYROSTAR™ ES-F están diseñados específicamente para reaccionar sólo con endotoxinas, no mostrando reactividad hacia (1→3)-β-D-glucano. Además, estos productos cumplen una doble función, formulados para su uso como coágulo de gel o como ensayo cinético turbidimétrico (KTA). Están disponibles en configuraciones de prueba única y multiprueba, lo que ofrece a los usuarios la posibilidad de elegir en función de sus necesidades. Estos reactivos son eficaces con muestras coloreadas o difíciles de cuantificar mediante el método KCA, ya que ofrecen cambios de color vibrantes para facilitar la visualización.

Contras
La serie PYROSTAR™ ES-F puede mostrar una diferencia en la concentración de la muestra entre las pruebas únicas y las múltiples en la solución de reacción, lo que podría dar lugar a resultados inexactos debido a una mezcla y/o dilución desiguales. Esta inconsistencia puede observarse como una ligera variación en las lecturas finales. En una prueba única, la muestra disuelve directamente el reactivo de lisado, mientras que en una multiprueba, ambos se mezclan. Esto significa que las pruebas únicas pueden verse más afectadas por la muestra.

Serie Limulus Color KY

Pros
Los ensayos de la serie Limulus Color KY están diseñados para detectar endotoxinas específicamente y no reaccionan al (1→3)-β-D-glucano. La serie ofrece kits de prueba única y múltiple, que emplean un sustrato sintético. Un color amarillo distintivo indica de forma confiable la presencia de endotoxinas, incluso a bajas concentraciones. Con cada kit de reactivos se suministra una endotoxina estándar de control (CSE) para fines de control de calidad. Estos reactivos son especialmente eficaces con muestras muy turbias o que presentan dificultades para la cuantificación mediante el ensayo turbidimétrico cinético (KTA), ya que ofrecen una mayor claridad y resultados más fiables.
Contras
Cuando se realiza la prueba con el Toxinometer, se requiere una mayor cantidad de reactivo LAL.

Prueba única Limulus PS

Pros
El Limulus PS Prueba única incluye viales específicos para endotoxinas LAL de prueba única y PyroSep™, una innovadora suspensión de resina de afinidad que se dirige a las endotoxinas y las elimina de las muestras, garantizando resultados precisos. Durante el uso del producto, la endotoxina de la muestra es arrastrada a la columna capilar, donde se adhiere al adsorbente PyroSep™ (histidina unida a un soporte mediante un espaciador), un proceso que puede monitorizarse visualmente o mediante instrumentación. La muestra se lava cuidadosamente para eliminar cualquier sustancia inhibidora, revelando la endotoxina que había sido adsorbida y que ahora puede medirse utilizando el reactivo de LAL en formato de prueba única.
Contras
La complejidad de esta prueba supera a la de las demás. Los analistas de endotoxinas experimentados encontrarán este método más adecuado debido a su complejidad y al requisito de conocimientos especializados.

Buffer ES

Pros
El buffer ES, perfecto para LAL sin tratamiento, se dirige específicamente a las endotoxinas. A diferencia de otros reactivos de LAL del mercado, todos los reactivos de LAL de FUJIFILM Wako LAL están diseñados específicamente para detectar endotoxinas. Sin este buffer, las pruebas pueden dar un falso positivo debido a interferencias, indicando de forma inexacta la concentración de endotoxinas de la muestra.
Los reactivos que no son de Wako LAL también son compatibles.

Equipo para reactivos de LAL

Agua de reactivo LAL

Pros
Derivada del Agua de Riego (WFI), el agua de reactivo LAL es adecuada para cumplir todos los requisitos de los ensayos de endotoxinas. Las diluciones del producto se realizan cuidadosamente utilizando agua de reactivo LAL (LRW) para garantizar la fiabilidad y reproducibilidad de los datos obtenidos con nuestros reactivos LAL específicos para endotoxinas.
Contras
Incluso un ligero cambio en el pH del agua de reactivo LAL tendrá un impacto significativo en los resultados finales, alterando las reacciones químicas e invalidando potencialmente el experimento. La cantidad de LRW añadida afecta significativamente a la precisión de la detección de endotoxinas, influyendo en la sensibilidad y fiabilidad del ensayo. Incluso ligeras desviaciones del volumen recomendado para una prueba específica pueden causar resultados inexactos y falsos negativos.

Tubos de reacción de coágulos de gel

Pros
El vidrio de borosilicato de alta calidad de nuestros tubos de reacción de coágulos de gel se somete a un proceso de despirogenación a 250°C, lo que da como resultado un producto superior libre de contaminantes. El tubo libre de endotoxinas resultante está optimizado para ensayos de coágulos de gel LAL, su diseño permite un rendimiento consistente tanto con bloques de calor como con baños de agua.
Contras
Los tubos de reacción de coágulo de gel están diseñados exclusivamente para el baño de agua o el bloque de calor y no son compatibles con los sistemas de medición Toxinometer.

Tubo de ensayo Limulus-S

Pros
Los tubos de ensayo Limulus-S están fabricados con vidrio de borosilicato de alta calidad despirogenado a 250°C para realizar ensayos fiables y estériles. Los tubos curvados con precisión permiten que pase la cantidad óptima de luz a través de la muestra, lo que permite una medición precisa de la concentración de endotoxinas utilizando el método especificado. La curvatura es crítica para obtener resultados consistentes. Este tubo de vidrio calibrado con precisión, con sus marcas grabadas, está diseñado para su uso con el sistema de medición Toxinometer®.
El tubo de ensayo Limulus-S es versátil y puede utilizarse para aplicaciones de baño de agua y bloques de calor.

Contras
Los tubos son más caros que los de coágulo de gel y se embalan con un máximo de 100 tubos por paquete.

Resumen

Los reactivos de LAL gozan de aceptación mundial para la detección de endotoxinas en productos farmacéuticos y dispositivos médicos, y han obtenido la aprobación de la FDA y su inclusión en farmacopeas de todo el mundo. A pesar de algunas deficiencias, los avances técnicos y la experiencia han mejorado la calidad de sus resultados.

Referencias:

1. Mehmood, Y., What Is Limulus Amebocyte Lysate (LAL) and Its Applicability in Endotoxin Quantification of Pharma Products. 2019.
2. Tamura, H., J. Reich, and I. Nagaoka, Outstanding Contributions of LAL Technology to Pharmaceutical and Medical Science: Review of Methods, Progress, Challenges, and Future Perspectives in Early Detection and Management of Bacterial Infections and Invasive Fungal Diseases. Biomedicines, 2021. 9(5).
3. Meisel, J., Determination of Pyrogens: Comparison of Different Methods. Altex, 1995. 12(2): p. 89-92.
4. 4. Flórez, P., et al., Intralaboratory Validation of a Kinetic Turbidimetric Assay Based on Limulus Amebocyte Lysate (LAL) for Assessing Endotoxin Activity in Cow Milk. Animals (Basel), 2023. 13(3).