O (1,3)-β-D-glucano e sua interferência no ensaio de LAL

O (1,3)-β-D-glucano é um polissacarídeo encontrado em uma grande variedade de plantas, fungos e bactérias. Este polímero pode ser encontrado substituído em diferentes posições da cadeia, e aparece de maneira natural em diferentes conformações, segundo a espécie, dependendo dos substitutivos que a estrutura possua e de sua posição espacial em relação aos outros grupos da cadeia.

Os β-D-glucanos possuem diferentes efeitos em mamíferos, são mediadores da resposta imune, agem ativando diferentes receptores da resposta proinflamatória. Em geral, não são digeridos no intestino, são substâncias que servem como fontes de energia aos diferentes micro-organismos que habitam no trato gastrointestinal através da fermentação. Estas moléculas têm sido utilizadas como método de diagnóstico de infecções por fungos em humanos, como aditivo alimentar por suas propriedades como prebióticos e como imunomodulares. Foram feitos estudos para seu uso como potenciais remédios por seus efeitos anticancerígenos e como redutores do colesterol, entre outros. Alguns dos β-glucanos mais estudados têm sido, por exemplo, o paramilo, procedente da Euglena gracilis e o curdlan, proveniente da Alcaligenes faecalis, para o qual se foi proposto uma estrutura de tripla hélice.

O ensaio de LAL é utilizado para a detecção de endotoxinas bacterianas, lipopolissacarídeos que, igualmente aos β-D-glucano, formam parte da parede celular de bactérias Gram-negativas. Para desenvolver o ensaio de LAL (Lisado de amebócitos de Limulus) é utilizada a hemolinfa do caranguejo Limulus Polyphemus, o caranguejo ferradura, daí o nome do ensaio. Os amebócitos contidos na hemolinfa deste caranguejo respondem com uma série de reações em cascata na presença de endotoxinas, como mecanismo de defesa contra estas substâncias altamente tóxicas. As reações do sistema imune provocam a coagulação das proteínas, que é o fenómeno utilizado como sinal analítico no ensaio de LAL.

No caranguejo ferradura, os β-D-glucanos, como nos mamíferos, também ativam os receptores do sistema imune que conduzem à aparição de coágulos, por isso são uma das principais interferências na determinação de endotoxinas bacterianas. A empresa Wako solucionou este problema acrescentando curdlan carboximetilado nos reagentes liofilizados que formam parte dos kits que distribuem para efetuar o ensaio de LAL. Os pesquisadores desta empresa descobriram que quando o curdlan carboximetilado é encontrado em altas concentrações, na dissolução onde é realizada a detecção de endotoxinas, deixa de provocar interferência no ensaio, que se converte em uma prova específica para endotoxinas.

Os kits da Wako são vendidos através da marca PYROSTAR™ e podem ser adquiridos para fins de pesquisa na web. Como se pode constatar na página web, esta empresa comercializa reagentes entre os quais estão incluídos os kits para quantificação de endotoxinas por diferentes métodos de detecção, como agua destilada libre de endotoxinas ou dissolução extratora de endotoxinas e acessórios que complementam os reagentes para o ensaio de LAL. Os acessórios para o ensaio de LAL são tanto os da série BioClean® (que possui tubos, pipetas, etc.), como endotoxina de controle padrão ou o Toxinometer® Série ET-6000, do qual falaremos no próximo artigo.

Bibliografia:

1. John A. Bohn, James N. BeMiller, Carbohydrate Polymers, 28, 1, 3-14, 1995.
2. Chan, G.C., Chan, W.K., and Sze, D.M., Journal of Hematology & Oncology, 2, 1-11, 2009.
3. Tsuchiya, M., Oishi, H., Takaoka, A., Fusamoto, M. and Matsuura, S., Chem Pahrm Bull (Tokyo), 38(9). p. 2523 (1990).

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