Comparando el método de LAL con el ensayo de pirógenos en conejos

El método de LAL (Lisado de ambocitos de Limulus) sustituyó en gran medida al ensayo de pirógenos que se realizaba utilizando conejos tanto en los experimentos que se llevan a cabo en investigaciones, como en la industria farmaceútica, alimentaria y otras, cuando se quiere comprobar el contenido de endotoxinas que existe en una muestra. Las endotoxinas bacterianas reciben este nombre por ser sustancias que forman parte de la pared celular de las bacterias Gram negativas que causan toxicidad en los humanos y muchos animales.

Como veremos en este artículo, existen varias razones por las que el metodo LAL es utilizado para la detección de endotoxinas bacterianas preferentemente al de conejos.

El ensayo de pirógenos en conejos se basa en la medida del aumento de la temperatura del conejo al ser inyectado con un producto que puede contener un contaminante de tipo pirógeno. Los pirógenos como su nombre indica son todas aquellas sustancias que causan el aumento de la fiebre, también llamada pirexia. Los conejos presentan una elevación de la temperatura, al entrar en contacto con los pirógenos, similar a los humanos. Por este motivo y por ser animales usados en los laboratorios con diversos fines se escogió para realizar este test.

Las desventajas del test de pirógenos usando conejos, para la determinación de endotoxinas bacterianas son numerosas:

• Es un ensayo largo, pues se debe medir la temperatura del animal durante las siguientes 3 horas después de la inyección en intervalos aproximados de 30 minutos.

• Deben usarse 3 animales por cada disolución a ensayar, estos no pueden haber presentado elevación de la temperatura en las dos semanas anteriores y no deben utilizarse los mismos animales hasta pasados dos días del ensayo. Además hay que escoger varios animales para el grupo control que tengan una temperatura estable por lo que se requiere tener a disposición gran cantidad de conejos para llevar acabo el test, sobre todo en las industrias con gran volumen de producción y se puede considerar un ensayo laborioso.

• Si se considera que muchas otras sustancias tanto endógenas como exógenas pueden causar la elevación de la temperatura en los conejos, esta resulta una gran limitante para usar este ensayo como determinación de endotoxinas en una muestra. Si bien es difícil que este test de como resultado un falso positivo debido a sustancias endógenas por el gran número de sujetos usados para el ensayo, es muy común que ofrezca resultados equívocos cuando las muestran se encuentran contaminadas por virus, hongos u otro tipo de sustancia que pueda causar fiebre en todos los animales del ensayo.

• Es un método inadecuado para determinar pirógenos en fármacos como los esteroides, los usados en quimioterapia y otros que pertenecen al gran grupo de sustancias que cuando son administradas el organismo puede responder con mecanismos que causan el aumento de la temperatura, siendo esta otra de las grandes limitantes de este ensayo cuando se están realizando investigaciones con fármacos o se trata del control de endotoxinas en la industria farmacéutica.

• Una desventaja muy grande es el hecho de no poder cuantificar el contenido de endotoxinas presentes en una muestra mediante este ensayo, que ofrece solo un resultado cualitativo.

• Existen productos, como aquellos que contienen plasma sanguíneo, donde las endotoxinas se encuentran en una forma inactiva que no producen fiebre al ser inoculadas, pero que con el transcurso del tiempo, debido a los procesos metabólicos que sufre el plasma dentro del organismo aparece la toxicidad. En estas ocasiones el método de pirógenos en conejos brinda un resultado falso negativo.

Método de LAL

El método de LAL debe su nombre a que se realiza con la hemolinfa del cangrejo herradura, cuyo nombre científico es Limulus Polyphemus. La hemolinfa de este cangrejo sufre un proceso de coagulación en presencia de endotoxinas bacterianas, que es el pirógeno que con mayor probabilidad puede encontrarse impurificando los reactivos y el material de laboratorio. La coagulación de la hemolinfa del cangrejo Limulus fue descubierta en la década de los 60 y al cabo de los años el mismo equipo de investigadores desarrolló un ensayo para la determinación cualitativa y cuantitativa de endotoxinas usando un lisado de amebocitos de cangrejo herradura. Este ensayo rápidamente comenzó a imponerse como método de determinación de endotoxinas bacterianas, teniendo como ventajas un bajo límite de detección, mayor especificidad, un menor coste, una menor variabilidad de los resultados y la posibilidad de cuantificar el contenido de endotoxinas. Si bien este ensayo también hace uso de animales, con las consecuencias éticas que tiene esto, la extracción de la hemolinfa no afecta la vida de los cangrejos.

Por todas las razones discutidas anteriormente el ensayo LAL es el método recomendado actualmente por las principales farmacopeas y organismos internacionales que regulan el control de calidad de medicamentos y alimentos. Existen casos como la vacuna de la hepatitis B donde se continuó con el uso del ensayo de pirógenos en conejos para la detección de endotoxinas pero se ha estudiado que realizando el ensayo de LAL por el método gel-clot y preparando las muestras de vacunas de manera adecuada es más conveniente usar el método de LAL, incluso en estas muestras donde existe interferencias que causan falsos resultados. Si bien el ensayo de LAL es específico para endotoxinas y no detecta otras sustancias pirógenas, en numerosos fármacos las endotoxinas son el pirógeno más común y el más dañino, por lo que un resultado negativo del ensayo de LAL es suficiente para determinar que la muestra es apta para el uso.

Desde que comenzó la demanda de reactivos y kits para realizar el ensayo de LAL diversas compañías en todo el mundo han estado trabajando en esta línea. La marca Pyrostar de Wako se dedica exclusivamente a brindar a los investigadores todos los reactivos, equipos y material de laboratorio necesario para la determinación de endotoxinas bacterianas mediante el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus. Para ello ofrece kits para la realización del test por los diferentes métodos de detección que son gelificación, método turbidimétrico y método colorimetría, tanto de manera cualitativa como cuantitativa.

Bibliografía:

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2) Trillo, F., Farmacia Galénica, Ed. Madrid, 1ra edición, 1993.

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4) Young, N. S., Levin, J., Prenderagst, R. A., J. Clin. Invest., 51, 1790-1797, 1972.

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